[發明專利]一種脂質體包裹人干細胞混懸液的制備方法

在審

• 申請號: 202011644831.4
• 申請日: 2020-12-24
• 公開（公告）號: CN112546072A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 蔡俊;吳建軍
• 申請（專利權）人: 蘇州倍樂勇生物科技有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K9/127;A61K47/28;A61K47/24;A61P17/00;A61P17/02;C12N5/0775
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本發明公開了一種脂質體包裹人干細胞混懸液的制備方法。本發明采用先分別制備的間充質干細胞培養液上清液和空白脂質體懸液混合，然后制得含間充質脂質體干細胞的脂質體混懸液，最后采用ELISA方法檢測臍帶間充質干細胞培養上清液中galectin?3的含量來判斷其免疫抑制效力。本發明在較短的培養時間內得到大量的人間充質干細胞，縮短了總的培養時間，可以用于治療皮膚皺紋、色斑和瘢痕。

技術領域

本發明屬于干細胞活性復合制劑技術領域，尤其涉及一種用于美容護膚的干細胞活性復合制劑及其制備方法。

背景技術

間充質干細胞(MSC)是一類早期未分化細胞，具有自我更新、自我復制、無限增殖及多向分化潛能等特點，可通過分泌細胞因子，減少炎癥、減少組織細胞凋亡、促進內源性組織器官的干祖細胞增殖及進行免疫調節，從而作為種子細胞達到修復組織器官的效果。連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，醫學界稱為“萬用細胞”。由于其免疫原性較低，細胞含量高、增殖能力優等特點，被廣泛應用于美容整形等領域。人間充質干細胞培養基上清，是人體間充質干細胞在增殖過程中，經過特殊培養后分泌出的多種生命活性物質，包括蛋白質、多肽、細胞生長因子等促進細胞生長、活化，再生等活性因子，經過特殊的分離提取工藝和加工手段，將其中的多種有效活性成分經過檢驗制備而成，使用一些常規方法，例如機械摩擦、紫外線照射和饑餓培養等方案，并不能顯著提高干細胞上清中因子的含量。此外，濃縮后的細胞培養基中，各種因子會在短時間內迅速降解和失活。

發明內容

本發明的主要目的是為了解決現有技術中的缺陷，提供一種脂質體包裹人干細胞混懸液的制備方法，本發明的方法誘導效率高、干細胞因子產量大，可短時間內獲得大量的干細胞因子。

為達到上述發明目的，本發明通過以下技術方案來實現：

第一步、取清洗干凈的臍帶碎塊，向50ml離心管中加入5ml臍帶碎塊和20ml2毫克/ml膠原酶IV，在37℃搖床上消化1.5-2小時，每管加入完全培養基到45ml刻度，在2200轉/分離心10分鐘，其中，完全培養基為DMEM/F12，并按體積比加入2％胎牛血清，培養條件為37℃，飽和濕度，5％CO₂培養箱中靜止培養，棄除上懸液，再將每個離心管中分散的細胞懸浮于40ml完全培養基中，每3天更換一次完全培養液，再使用磷酸鹽緩沖鹽水清洗培養的細胞2次，質量百分數為0.25％胰酶-EDTA消化，待細胞懸浮后加入2.5ml5％FBS培養基，在1000轉/分離心10分鐘，再懸浮于總量40ml質量百分數為5％FBS培養基，每3天換一次5％FBS培養基，培養細胞直到長滿90％面積，從此開始收集培養上清液，凍存在-20℃，得間充質干細胞培養液上清液；第二步、將磷脂、膽固醇、吐溫-80和抗氧化劑溶于無水乙醇中，其中，磷脂、膽固醇、吐溫-80和抗氧化劑的總質量與無水乙醇的質量比為1∶3～1∶4，將混合特旋轉蒸發，控制水浴溫度35-40℃，旋轉轉速20～80r/min，真空度維持在0.010-0.020MPa，直至溶劑去除將薄膜洗下，得到乳濁液，再將乳濁液置攪拌30-50min，控制攪拌器溫度為40-45℃，轉速為60～100r/min，攪拌結束后再進行超聲整粒，得到空白脂質體懸液；第三步：將上述制備的間充質干細胞培養液上清液和空白脂質體懸液混合，制得含間充質脂質體干細胞的脂質體混懸液。脂質體混懸液采用ELISA方法檢測臍帶間充質干細胞培養上清液中galectin-3的含量來判斷其免疫抑制效力，人臍帶間充質干細胞培養上清液中galectin-3的含量低于2.5ng/ml判定為人臍帶間充質干細胞免疫抑制效力不合格，制得的干細胞混懸液可以用于治療皮膚皺紋、色斑和瘢痕。

本發明公開的一種脂質體包裹人干細胞混懸液的制備方法的有益效果是：由于本發明本生產方法取材于健康人的臍帶組織，膠原酶消化之后，經體外培養，在較短的培養時間內得到大量的人間充質干細胞(MSC)，進一步收集得大量的MSC培養上清液，縮短了總的培養時間。

具體實施方式

實施例一