[發明專利]一種脂質體包裹人干細胞混懸液的制備方法

在審

• 申請號: 202011644831.4
• 申請日: 2020-12-24
• 公開（公告）號: CN112546072A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 蔡俊;吳建軍
• 申請（專利權）人: 蘇州倍樂勇生物科技有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K9/127;A61K47/28;A61K47/24;A61P17/00;A61P17/02;C12N5/0775
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1.一種脂質體包裹人干細胞混懸液的制備方法，其特征在于：包含如下步驟：

第一步、取清洗干凈的臍帶碎塊，向50毫升離心管中加入5毫升臍帶碎塊和20毫升2毫克/毫升膠原酶IV，在37℃搖床上消化1.5-2小時，每管加入完全培養基到45毫升刻度，在2200轉/分離心10分鐘，其中，完全培養基為DMEM/F12，并按體積比加入2％胎牛血清，培養條件為37℃，飽和濕度，5％CO₂培養箱中靜止培養，棄除上懸液，再將每個離心管中分散的細胞懸浮于40毫升完全培養基中，每3天更換一次完全培養液，再使用磷酸鹽緩沖鹽水清洗培養的細胞2次，質量百分數為0.25％胰酶-EDTA消化，待細胞懸浮后加入2.5毫升5％FBS培養基，在1000轉/分離心10分鐘，再懸浮于總量40毫升質量百分數為5％FBS培養基，每3天換一次5％FBS培養基，培養細胞直到長滿90％面積，從此開始收集培養上清液，凍存在-20℃，得間充質干細胞培養液上清液；

第二步、將磷脂、膽固醇、吐溫-80和抗氧化劑溶于無水乙醇中，其中，磷脂、膽固醇、吐溫-80和抗氧化劑的總質量與無水乙醇的質量比為1∶3～1∶4，將混合特旋轉蒸發，控制水浴溫度35-40℃，旋轉轉速20～80r/min，真空度維持在0.010-0.020MPa，直至溶劑去除將薄膜洗下，得到乳濁液，再將乳濁液置攪拌30-50min，控制攪拌器溫度為40-45℃，轉速為60～100r/min，攪拌結束后再進行超聲整粒，得到空白脂質體懸液；

第三步：將上述制備的間充質干細胞培養液上清液和空白脂質體懸液混合，制得含間充質脂質體干細胞的脂質體混懸液。

2.根據權利要求1所述的一種脂質體包裹人干細胞混懸液的制備方法，其特征在于所述的脂質體混懸液采用ELISA方法檢測臍帶間充質干細胞培養上清液中galectin-3的含量來判斷其免疫抑制效力，人臍帶間充質干細胞培養上清液中galectin-3的含量低于2.5ng/ml判定為人臍帶間充質干細胞免疫抑制效力不合格。

3.根據權利要求1所述的一種脂質體包裹人干細胞混懸液的制備方法，期特征在于制得的干細胞混懸液可以用于治療皮膚皺紋、色斑和瘢痕。