[發明專利]一種抗砷雙基因表達載體及其構建方法

在審

• 申請號: 202011643096.5
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112746081A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 高啟禹;徐光翠;畢佳佳;趙英政;王紅濤
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12R1/01
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明涉及基因工程技術領域，具體公開了一種抗砷雙基因表達載體及其構建方法，所述抗砷雙基因表達載體pCVD442KS?AA?HR的具體構建過程為：合成AoxAB基因和ArsM基因，克隆在pUC19載體的SalI和HindIII位點之間，構建獲得pUC19?AA質粒，然后在pUC19?AA質粒的HindIII位點處克隆入重組手臂HR，獲得質粒pUC19?AA?HR，pUC19?AA?HR質粒上的打靶片段經XbaI切割后亞克隆入革蘭氏陰性菌自殺質粒pCVD442KS上，得到抗砷雙基因表達載體pCVD442KS?AA?HR。所述抗砷雙基因表達載體pCVD442KS?AA?HR為后續工作積累了基礎條件，對A.ferrooxidan的定向育種與改良起到奠定作用。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種抗砷雙基因表達載體及其構建方法。

背景技術

砷作為一種在地球化學循環中普遍存在的劇毒類金屬元素，在自然界中分布非常廣泛，Srivastava等預計每年從大陸表面經揮發進入大氣中的砷含量約達到2.1×10⁷kg，其中進入人畜飲食鏈的砷元素對機體的健康威脅更大。同時存在于硫化礦和電子垃圾中的砷會在各種氣候因子和生態因子的作用下進入土壤、地下水和空氣中，對環境造成嚴重的砷污染。對目前已知的砷污染問題進行梳理發現，含砷電子垃圾(如手機和電腦電路板)引起的砷污染問題已成為相關研究的熱點和難點之一。而且隨著手機及電腦更新換代速度的加快，導致其實際使用壽命被大大縮短，也使含砷廢電路板的數量呈逐年增加之趨勢。

存在于自然界中的砷及其化合物的毒性與砷的形態有關，通常無機砷的毒性高于有機砷，亞砷酸鹽的毒性要遠遠高于砷酸鹽，而且與砷酸鹽相比，亞砷酸鹽在砷的地球循環中更易移動，在水體環境中更加穩定。同時研究發現亞砷酸鹽能夠通過轉運蛋白或甘油載體進入細胞，并特異地與多種功能蛋白或酶的巰基基團結合，導致蛋白變性及酶的活性喪失，因此將亞砷酸鹽氧化為弱毒性且易吸附去除的砷酸鹽是解毒的有效途徑之一。但砷酸鹽仍被認為是一種劇毒類的化合物，小鼠經口LD50為238mg/kg，大鼠經口LD50為48mg/kg，同時砷酸鹽的負電荷屬性也使其在環境中容易積累，因此將砷酸鹽進一步轉化為甲基化產物，將從根本上弱化砷在環境中的毒性影響。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(A.ferrooxidan)作為一種重要的抗砷嗜酸微生物，在與各種砷離子的長期共存中進化出了其獨特的抗砷機制，但前期研究證實，作為自然分離的原始菌株，通過馴化后雖然具備了一定的三價砷吸附和轉化能力，但其作用能力非常有限，而且不具備砷的甲基化功能，嚴重限制和影響了A.ferrooxidan對含砷廢電路板的有價金屬浸出、生物冶金及在含砷廢水廢渣治理等領域中的應用。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種抗砷雙基因表達載體及其構建方法，為抗砷基因工程菌的構建奠定了前期基礎。

本發明提供了一種抗砷雙基因表達載體，所述抗砷雙基因表達載體為pCVD442KS-AA-HR，所述抗砷雙基因表達載體構建過程為：合成AoxAB基因和ArsM基因，克隆在pUC19載體的SalI和HindIII位點之間，構建了pUC19-AA質粒，然后在pUC19-AA質粒的HindIII位點處克隆入重組手臂HR，獲得pUC19-AA-HR質粒，pUC19-AA-HR質粒上的AA-HR片段經XbaI切割后亞克隆入革蘭氏陰性菌自殺質粒pCVD442KS上，得到抗砷雙基因表達載體pCVD442KS-AA-HR。

本發明還提供了上述抗砷雙基因表達載體的構建方法，包括如下步驟：

S1，pUC19-AA質粒的克隆：ArsM和AoxAB基因經基因合成，克隆在pUC19載體的SalI和HindIII位點之間，獲得pUC19-AA質粒；

S2，重組手臂HR的擴增：以基因組A.ferrooxidan BY3的DNA為模版，以HR-F和HR-R為引物進行擴增，獲得擴增產物；

所述HR-F引物的基因序列如SEQ ID NO.1所示；