[發明專利]一種抗砷雙基因表達載體及其構建方法

在審

• 申請號: 202011643096.5
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112746081A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 高啟禹;徐光翠;畢佳佳;趙英政;王紅濤
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/66;C12R1/01
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

1.一種抗砷雙基因表達載體，其特征在于，所述抗砷雙基因表達載體為pCVD442KS-AA-HR，所述抗砷雙基因表達載體構建過程為：合成AoxAB基因和ArsM基因，克隆在pUC19載體的SalI和HindIII位點之間，構建了pUC19-AA質粒，然后在pUC19-AA質粒的HindIII位點處克隆入重組手臂HR，獲得pUC19-AA-HR質粒，pUC19-AA-HR質粒上的AA-HR片段經XbaI切割后亞克隆入革蘭氏陰性菌自殺質粒pCVD442KS上，得到抗砷雙基因表達載體pCVD442KS-AA-HR。

2.如權利要求1所述的抗砷雙基因表達載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1，pUC19-AA質粒的克隆：ArsM和AoxAB基因經基因合成，克隆在pUC19載體的SalI和HindIII位點之間，獲得pUC19-AA質粒；

S2，重組手臂HR的擴增：以基因組A.ferrooxidan BY3的DNA為模版，以HR-F和HR-R為引物進行擴增，獲得擴增產物；

所述HR-F引物的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

所述HR-R引物的基因序列如SEQ ID NO.2所示；

S3，將S2的PCR產物經酚、氯仿處理后，異丙醇沉淀，溶于無菌去離子水中，按兩側的設計位點，使用限制性內切酶HindIII進行酶切，待載體酶切反應結束后，分離純化，再進行連接反應，在pUC19-AA質粒的HindIII位點處克隆入HR，獲得含有完整打靶片段AA-HR的質粒pUC19-AA-HR；

S4，將pUC19-AA-HR克隆轉接至LB培養基進行質粒制備，其后用XbaI將AA-HR從重組質粒上切割并與相同酶切的自殺質粒pCVD442連接和轉化，取產物進行二次連接反應，pUC19-AA-HR質粒上的AA-HR片段經XbaI切割后亞克隆入革蘭氏陰性菌自殺質粒pCVD442KS上，得到抗砷雙基因表達載體pCVD442KS-AA-HR。

3.如權利要求2所述的抗砷雙基因表達載體的構建方法，其特征在于，S2中，擴增反應體系為：菌液0.5μL，10×Pfu buffer5μL，25mM dNTP 0.4μL，50pmol/μL HR-F 0.5μL，50pmol/μL HR-R 0.5μL，5U/μL Pfu DNA polymerase 0.5μL，dH₂O43μL，總體系為50μL。

4.如權利要求3所述的抗砷雙基因表達載體的構建方法，其特征在于，S2中，擴增條件為：95℃預變性5min；再進行35個循環，重復2-4次，每個循環的條件為95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃終延伸7min。

5.如權利要求2所述的抗砷雙基因表達載體的構建方法，其特征在于，S3中，酶切反應體系為500ng/μL pUC19-AA 4μL，HR43μL，10×R buffer 10μL，10U/μL HindIII 4μL，ddH₂O39μL，反應總體積100μL。

6.如權利要求2所述的抗砷雙基因表達載體的構建方法，其特征在于，S3中，連接反應體系的總體積為10μL，分別為50ng/μL pUC19-AA酶切去磷產物4μL，50ng/μL HR酶切產物4μL，10×T4 buffer1μL，5U/μL T4 DNA ligase 1μL。

7.如權利要求2所述的抗砷雙基因表達載體的構建方法，其特征在于，S4中，質粒pCVD442KS-AA-HR構建的連接體系總體積為50μL，各組分的體積為：250ng/μL pCVD442KS4μL，10×Tango buffer 5μL，10U/μL XbaI 2μL，ddH₂O39μL。