[發明專利]一種使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法

在審

• 申請號: 202011640837.4
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112813120A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 陳庭堅;何傳平;鄒金容;張汝潔;彭樂麗;王光遠;吳靜
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍;江裕強

本發明屬于生物技術領域，公開了一種使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法。該方法包括：將含目標序列的單鏈DNA、聚合酶緩沖溶液、5’末端帶修飾的DNA寡核苷酸鏈的引物混合均勻，升溫進行去空間結構處理再降溫退火，得到混合體系1；往混合體系1中加入核糖核苷酸，SFM4?3聚合酶，混合均勻，得到轉錄體系，孵育，純化分離RNA，得到目標序列的5’標記RNA。本發明提供的方法，利用定向改造獲取的熱穩定DNA聚合酶在合成RNA的時候直接實現對所有RNA產物5’末端的熒光素或生物素等標記，并且在實現標記的同時仍然保持RNA分子的活性與功能。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法。

背景技術

在核酸分子的研究和應用中，單鏈RNA末端標記是一項很重要的技術。單鏈RNA末端標記是將標記物(如熒光素、生物素等)通過一定的方式連接到RNA的5’末端或者RNA的3’末端，通過檢查標記物，進而實現對RNA鑒別、檢測，或對功能核酸(如RNA適配體)進行親和力測定和應用開發。

單鏈RNA末端標記主要分為化學標記和酶法標記。化學標記難度大，成本高，而酶法標記比化學標記簡單方便。單鏈RNA的5’末端標記和3’末端標記的方法各不相同。單鏈RNA的3’末端標記技術主要通過TdT法和T4 RNA連接酶法在RNA 3’末端增加一個修飾的核苷酸或者帶修飾的小核酸片段。單鏈RNA的5’末端標記技術比較復雜，一般是先利用T4多聚核苷酸激酶對RNA的5’末端進行磷酸化，然后在T4 RNA連接酶的作用下，與一條通過化學修飾的寡核苷酸鏈連接。由于T4 RNA連接酶將帶修飾的DNA片段連接到磷酸化的RNA 5’或3’末端的反應效率都較低，難以保證所有目標RNA分子的完全標記，單鏈RNA5’末端標記又一直沒有很好的技術，因此使用該方法進行RNA的5’末端標記仍然比較困難。

RNA適配體是指在沒有互補鏈存在的情況下，自身經過卷曲和折疊，形成特定的三級結構，并對靶標分子具有高親和力和高特異性的單鏈RNA分子。RNA適配體文庫經指數富集的配體系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment,SELEX)篩選后，需要通過親和力表征確定是否成功篩選到RNA適配體，而RNA的末端標記是測定RNA適配體親和力的重要技術工具。RNA適配體的末端標記要符合以下要求：1)不破壞適配體的結構；2)不影響適配體對靶標的親和力；3)標記物靈敏度高。已報道的RNA適配體親和力測定都是采用放射性標記，此方法具有一定的危險性，需要專門的實驗條件和資源，無法普及。單鏈RNA的5’末端標記技術又難以滿足需求，因此RNA適配體末端標記還沒有簡便、安全、高效的方法。

SFM4-3聚合酶是以Taq DNA聚合酶的催化結構域SF片段為進化起點，通過使用噬菌體展示系統經定向進化后具有轉錄活性的DNA聚合酶。經過改造的SFM4-3聚合酶能識別2’-F/2’-OMe修飾的核糖核苷酸，并且可以直接轉錄合成天然的RNA以及帶修飾的非天然RNA鏈。與T7 RNA聚合酶轉錄RNA不同，SFM4-3聚合酶轉錄RNA時不需要啟動子，而是以單鏈DNA為模板，從DNA引物的3’末端開始延伸，直到模板的5’末端結束。由于使用SFM4-3聚合酶突變株進行的RNA以及修飾RNA的轉錄具有這一特點，所以可以方便地通過DNA引物在轉錄產物的5’端快速地引入各種標記。同時，如果選取適當的DNA引物，5’端的標記以及DNA小片段也不會對RNA轉錄產物的活性與功能產生太大的影響。

發明內容

為了克服現有技術存在的不足，本發明的目的是提供一種使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法。

本發明的目的至少通過如下技術方案之一實現。

本發明提供了一種簡便、高效的RNA5’末端加標記的方法。該方法以含目標序列的單鏈DNA為模板，以5’末端帶修飾的DNA寡核苷酸鏈為引物(由15個胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸組成)，通過使用定向改造獲取的SFM4-3聚合酶轉錄合成5’標記的目標RNA或糖環修飾/非天然RNA。