[發明專利]一種使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法

在審

• 申請號: 202011640837.4
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112813120A
• 公開（公告）日: 2021-05-18
• 發明（設計）人: 陳庭堅;何傳平;鄒金容;張汝潔;彭樂麗;王光遠;吳靜
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍;江裕強

1.一種使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將含目標序列的單鏈DNA、聚合酶反應緩沖液、5’末端帶修飾的DNA寡核苷酸鏈的引物混合均勻，得到混合液，然后升溫進行去空間結構處理，冷卻至室溫，得到混合體系1；

(2)往步驟(1)所述混合體系1中加入核糖核苷酸，SFM4-3聚合酶，混合均勻，得到轉錄體系；

(3)將步驟(2)所述轉錄體系進行孵育處理，得到轉錄產物，純化分離RNA，得到目標序列的5’標記RNA。

2.根據權利要求1所述的使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法，其特征在于，步驟(1)所述聚合酶反應緩沖液包含400-600mM的Tris、400-600mM的MgCl₂、60-70mM的KCl；所述混合液的pH值為8.0-9.0。

3.根據權利要求1所述的使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法，其特征在于，步驟(1)所述5’末端帶修飾的DNA寡核苷酸鏈的引物包括15個胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸及修飾部分；所述修飾部分為生物素標記、熒光素標記、放射性標記中的一種以上；在步驟(1)所述混合液中，含目標序列的單鏈DNA的終濃度為400-600nM，Tris的濃度為40-60mM、MgCl₂的濃度為40-60mM、KCl的濃度為6-7mM，5’末端帶修飾的DNA寡核苷酸鏈的引物的終濃度為400-1200nM。

4.根據權利要求1所述的使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法，其特征在于，步驟(1)所述去空間結構處理的溫度為90-98℃，去空間結構處理的時間為2-5min。

5.根據權利要求1所述的使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法，其特征在于，步驟(2)所述核糖核苷酸包括天然的核糖核苷酸和非天然核糖核苷酸中的一種以上；所述天然的核糖核苷酸包括ATP、UTP、GTP、CTP；非天然核糖核苷酸包括糖基2’位修飾的ATP、糖基2’位修飾的UTP、糖基2’位修飾的GTP、糖基2’位修飾的CTP；所述修飾為2’-F、2’-OMe、2’-N₃、2'-Cl、2'-NH₂中的一種以上。

6.根據權利要求5所述的使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法，其特征在于，當使用的核糖核苷酸為天然的核糖核苷酸時，在所述轉錄體系中，ATP、UTP、GTP、CTP的濃度相同；當使用的核糖核苷酸為非天然的核糖核苷酸時，糖基2’位修飾的ATP、糖基2’位修飾的UTP、糖基2’位修飾的GTP、糖基2’位修飾的CTP的濃度相同。

7.根據權利要求1所述的使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法，其特征在于，步驟(2)所述的SFM4-3聚合酶的序列如SEQ ID NO.1所示；在步驟(2)所述轉錄體系中，核糖核苷酸的終濃度為0.2-0.6mM，SFM4-3聚合酶的終濃度為0.8-1.6μM。

8.根據權利要求1所述的使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法，其特征在于，步驟(3)所述孵育處理的溫度為45-70℃，孵育處理的時間為8-16h。

9.根據權利要求1所述的使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法，其特征在于，步驟(3)所述純化分離RNA，包括：

將轉錄產物經過變性膠分離后，切膠回收5’末端帶標記的RNA，完成RNA的純化分離。

10.根據權利要求1所述的使用DNA聚合酶突變株高效合成5’標記RNA的方法，其特征在于，步驟(3)所述5’標記RNA為RNA適配體。