[發明專利]一種Alport綜合征小鼠模型的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202011640010.3
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112779286B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 李曉軍;張家勛;吳維青;孫寧;楊陽;崔英霞
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍東部戰區總醫院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 萬婧

本發明屬于動物模型的制備方法領域，具體為一種基于CRISPR/Cas9技術的Col4a5基因Del?ATGG突變動物模型的構建。本發明通過CRISPR/Cas9基因剪輯技術，敲除小鼠Col4a5基因上的特定位點，使得其基因失活，誘導產生Alport綜合征。本發明還提供了評價該Alport綜合征小鼠模型的方法。該遺傳病模型將助力于Alport綜合征的發病機制和治療靶點等領域的研究。

技術領域

本發明屬于利用基因修飾技術制作基因突變動物模型技術領域，具體涉及一種基于CRISPR/Cas9技術的Col4a5基因Del-ATGG突變動物模型的構建方法。

背景技術

CRISPR/Cas(Clustered?Regularly?Interspaced?Shot?Palindromic?repeats/CRISPR-associated)系統是原核生物中一種抵抗外源基因侵入的獲得性免疫系統，在細菌和古生菌中CRISPR系統整合侵入宿主的噬菌體或者質粒DNA片段到CRISPR位點，然后通過相應的CRISPR?RNAs(cr?RNAs)引導Cas核酸內切酶對外源DNA序列進行切割，從而抵抗病毒或者噬菌體的入侵。CRISPR/Cas系統分為3種類型(Type?I、Type?II和Type?III)，其中TypeII系統因其簡單、高效以及功能多樣化等優點，自2013在哺乳動物細胞中成功實現基因編輯后，現已被廣泛用于多種模式生物的基因組修飾技術應用中。II型系統可以通過crRNA的引導利用單個Cas9核酸酶對DNA靶位點進行精確充分地切割。CRISPR/Cas9系統相關載體構建簡單快速，便于操作，實驗周期較短，且廣泛適用于多個物種。在基因編輯的過程中，CRISPR/Cas9系統需要一段特殊的引導RNA，即sgRNA(single?guide?RNA)，sgRNA的序列選擇限制性較小，只需要基因組序列中出現PAM(NGG)區即可。在sgRNA的引導下，Cas9蛋白可以對基因組實現定點切割，引起DNA雙鏈斷裂，繼而引發細胞的自主修復，修復的過程可以是隨機的片段缺失或插入，也可以利用特定的模板修復，從而實現對基因組的永久性修飾。

Alport綜合征是一種遺傳性基底膜疾病，由于腎小球疾病、可變感音神經性聽力損失和各種眼部異常而導致進行性腎功能衰竭。Alport綜合征是一種遺傳異質性疾病，其所有形式都是由編碼IV型膠原的基因突變引起的，而IV型膠原是基底膜的主要結構成分，Ⅳ型膠原有α1～α6共6種α鏈，分別由COL4A1～6基因編碼，根據組織分布的不同，這6種α鏈螺旋組成三種不同的三聚體：α1α1α2、α3α4α5、α5α5α6。在胚胎形成時期，α1α1α2三聚體廣泛分布于各組織基底膜中；隨著組織分化，腎小球基底膜、耳蝸、眼、睪丸、肺等組織中的α1α1α2前體逐漸被α3α4α5三聚體替代，而Bowman囊、皮膚、食管、平滑肌等組織的α1α1α2(Ⅳ)三聚體則被α5α5α6(Ⅳ)替代。研究認為，α1α1α2(Ⅳ)三聚體易被內切蛋白酶水解，由α3α4α5(Ⅳ)三聚體組成的Ⅳ型膠原交聯結構更加穩定、抗蛋白水解能力更強。因此，α3α4α5(Ⅳ)三聚體對維持腎小球基底膜結構完整和功能穩定是必不可少的。在腎小球基底膜上，只有足細胞能合成并分泌α3α4α5(Ⅳ)三聚體，而α1α1α2(Ⅳ)三聚體可由足細胞、內皮細胞及系膜細胞合成，因此，足細胞是Alport綜合征發病機制的關鍵細胞。當編碼α3～α5鏈的基因發生突變時，足細胞不能合成成熟的α3α4α5三聚體，導致腎小球基底膜結構穩定性降低并且出現分層。而基底膜和足細胞直接存在相互作用，異常的腎小球基底膜可能通過影響兩者間的整合素復合體導致足細胞損傷，損傷的足細胞傳遞觸發周圍完整足細胞產生二次損傷，足細胞的這種損傷傳遞機制形成了一個惡性循環，加速了足細胞融合和腎小球硬化，腎小球濾過屏障受損出現蛋白。