[發明專利]一種水稻中轉基因的檢測方法

在審

• 申請號: 202011639428.2
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112725423A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 張萍;張莉;李丹;韓文書
• 申請（專利權）人: 鎮江華大檢測有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 南京創略知識產權代理事務所(普通合伙) 32358
• 代理人: 朱希敏

1.一種水稻中轉基因的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟，

(1)準備測定的主要儀器；

(2)對樣品進行制樣；

(3)對水稻中的DNA模板制備；

(4)對水稻中的DNA濃度測定；

(5)對檢測結果分析和判定。

2.根據權利要求1所述的一種水稻中轉基因的檢測方法，其特征在于：所述步驟(1)中，主要儀器：定量PCR儀；冷凍研磨儀；消毒滅菌鍋；制冰機；核酸蛋白分析儀；高速冷凍離心機，臺式小型離心機，Mini個人離心機；低溫冰箱；旋渦振蕩器和微量移液器。

3.根據權利要求1所述的一種水稻中轉基因的檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中，稱取約200g水稻樣品，用粉碎機或冷凍研磨儀將樣品粉碎至細粉狀。

4.根據權利要求1所述的一種水稻中轉基因的檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中，DNA模板制備：每個樣品提取2個平行管，稱取200mg粉碎的樣品，加入1mL預冷至4℃的抽提液，劇烈搖動，棍勻后，在冰上靜置5min,4℃條件下10OOOg離心15min，棄上清液，放入600μL預熱到65℃的裂解液，充分重懸沉淀，在65℃恒溫保持40min，期間顛倒棍勻5次；室溫條件下，10OOOg離心10min，取上清液轉至另一新離心管中；加入5μLRNaseA，37℃恒溫保持30min，分別用等體積苯酣g異戊醇洛液和三氯甲皖z異戊醇榕液各抽提一次；室溫條件下，10OOOg離心10min，取上清液轉至另一新離心管中；加入三分之二體積異丙醇，十分之一體積3mol/L乙酸餉溶液，零下20℃放置2h-3h；在4℃條件下，10OOOg離心15min，棄上清液，用70％乙醇洗滌沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀，加入50μL TE溶解沉淀，所得溶液即為樣品DNA梅液。

5.根據權利要求1所述的一種水稻中轉基因的檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中，采用紫外分光光度法測定DNA濃度，所測得OD值為核酸總量，紫外分光光度法檢測核酸濃度的最佳范圍是2μg/mL-50μg/mL,OD值應該在0.05-l的區間內，將DNA溶液做適當的稀釋，放入紫外分光光度計的比色皿中，于260nm處測定其吸收峰，lOD2sonm＝50μg/mL雙鏈DNA或38μg/mL單鏈DNA，PCR級DNA搭液的OD2sonm/0D2som比值為1.7：2.0。

6.根據權利要求1所述的一種水稻中轉基因的檢測方法，其特征在于：所述步驟(5)中，檢測結果分析：按預先設定的樣品擺放順序將PCR反應管依次擺放，開始運行儀器進行實時熒光PCR反應，實時熒光PCR反應結束后，設置熒光信號|萄值，闊值設定原則根據儀器噪聲情況進行調整，以闊值線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。

7.根據權利要求1所述的一種水稻中轉基因的檢測方法，其特征在于：所述步驟(5)中，結果判定：測試樣品外源基因檢測Ct值等于40，判斷該樣品不含所檢的外源基因；

測試樣品外源基因檢測Ct值小于或等于36，判斷該樣品含有所檢測的外源基因；

測試測試樣品外源基因檢測Ct值在36-40之間，應調整模塊濃度，重新做實時熒光PCR，再次擴增后的外游、基因檢測Ct值仍小于40，則可判定為改樣品檢出外源轉基因，再次擴增后的外游、基因檢測Ct值等于40，則可判定為改樣品未檢出外源轉基因。