[發(fā)明專利]提高細(xì)胞產(chǎn)生單克隆的能力的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011637383.5
• 申請(qǐng)日: 2020-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112662704A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王琦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇集萃醫(yī)學(xué)免疫技術(shù)研究所有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/53;C12N5/10
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 宋明

本發(fā)明提供提高細(xì)胞增殖能力的方法。通過(guò)對(duì)特定基因進(jìn)行基因編輯，能夠顯著提高難以生產(chǎn)單克隆的細(xì)胞株在低接種密度的增殖能力，從而可以利用其生產(chǎn)單克隆。獲得的細(xì)胞的單克隆可以穩(wěn)定永久的進(jìn)行無(wú)限傳代，并且在使用這樣的細(xì)胞株生產(chǎn)單克隆的過(guò)程中，不需要添加外源生長(zhǎng)因子或使用特殊的培養(yǎng)基。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過(guò)基因編輯方法提高細(xì)胞增殖能力的方法。具體涉及提高難以形成單克隆的細(xì)胞系增殖能力，從其生產(chǎn)單克隆的方法。

背景技術(shù)

細(xì)胞單克隆廣泛用于抗體的生產(chǎn)及基因功能研究、蛋白通路研究等科研領(lǐng)域，蛋白生產(chǎn)、抗體生產(chǎn)、藥理研究、新藥開(kāi)發(fā)等生物醫(yī)藥領(lǐng)域等中，在單抗藥物不斷增多的今天，需要利用越來(lái)越多的細(xì)胞株形成單克隆。

但存在以下問(wèn)題：細(xì)胞種類千差萬(wàn)別，并非所有細(xì)胞都能成功形成細(xì)胞單克隆，而且，為了提供細(xì)胞形成單克隆的個(gè)體化環(huán)境，有時(shí)需要向培養(yǎng)基中加入各種細(xì)胞因子，甚至配置特殊的培養(yǎng)基。而由于細(xì)胞之間的差異，許多細(xì)胞株所適用的細(xì)胞因子需要通過(guò)大量條件摸索才能確定，甚至無(wú)法找到對(duì)應(yīng)的細(xì)胞因子。這兩個(gè)問(wèn)題限制了應(yīng)用于生產(chǎn)單克隆的細(xì)胞種類。

具體地，對(duì)于細(xì)胞單克隆成功形成，受到單克隆的生長(zhǎng)時(shí)間限制、存在獲得單個(gè)陽(yáng)性克隆的幾率即單克隆形成率極低等問(wèn)題。單克隆形成率受多種因素影響，其中，細(xì)胞的增殖活力最為重要。現(xiàn)有技術(shù)中，一般采用如下兩種方法提高細(xì)胞的增殖活力：

(1)適當(dāng)傳代：使用梯度稀釋法接種細(xì)胞后，培養(yǎng)至細(xì)胞形成克隆。將每個(gè)孔中的克隆進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至96孔板的新孔中。當(dāng)新孔中細(xì)胞生長(zhǎng)至80％的匯合度，將孔中細(xì)胞轉(zhuǎn)移至48孔板的一個(gè)孔中。使細(xì)胞繼續(xù)增殖生長(zhǎng)至獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞用于驗(yàn)證分析。

(2)添加合適的輔助因子、細(xì)胞因子：盡管血清中含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加適量的添加劑，例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和硒可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)于某些細(xì)胞系，乙醇胺可能也很重要。在某些情況下，附著因子，如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、玻璃粘連蛋白和生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)也是有益的。

但是，由于細(xì)胞系來(lái)源的多樣，有些細(xì)胞例如THP-1、Caco-2、SHY5Y等難以生產(chǎn)單克隆。這些細(xì)胞的增殖與其特性密切相關(guān)，必須依賴于細(xì)胞間的作用和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，因此需要較高的接種密度，當(dāng)在細(xì)胞密度低的時(shí)候則幾乎無(wú)法形成單克隆。

具體例如，作為人B淋巴母細(xì)胞系的HMy2.CIR細(xì)胞，衍生自HMy.2B淋巴母細(xì)胞系，其為ARH-77細(xì)胞系(ATCC CRL-1621)的快速生長(zhǎng)突變體，通過(guò)伽馬射線照射和選擇而缺失HLAI類抗原表達(dá)。該細(xì)胞系常用于電離輻射等條件下，對(duì)細(xì)胞功能及作用機(jī)制進(jìn)行研究的細(xì)胞模型。HL-60細(xì)胞是來(lái)源于一個(gè)36歲患急性早幼粒細(xì)胞白血病的女性，主要為嗜中性的早幼粒細(xì)胞，其是血液腫瘤細(xì)胞中常用的細(xì)胞株系，經(jīng)常應(yīng)用于急性髓系白血病等血液腫瘤的藥效學(xué)和機(jī)制研究。經(jīng)單克隆測(cè)試發(fā)現(xiàn)，若以相當(dāng)于96孔板中約10cells/孔的細(xì)胞接種密度培養(yǎng)，這兩種細(xì)胞都無(wú)法在96孔板中生產(chǎn)單克隆。

對(duì)這些細(xì)胞而言，即使進(jìn)行傳代或添加合適的輔助因子，也不能使得這類細(xì)胞的單克隆存活生長(zhǎng)。并且，這類依賴于細(xì)胞密度生長(zhǎng)的細(xì)胞株由于在低接種密度下增殖能力差，不適用于形成單克隆常用的有限稀釋、梯度稀釋、半固體培養(yǎng)基鋪板、流式細(xì)胞儀分選等等實(shí)驗(yàn)方法，這制約了對(duì)這類細(xì)胞的應(yīng)用開(kāi)發(fā)和功能研究。因此，需要提高其在低接種密度下的增殖能力，使其獲得形成單克隆的能力，從而得到穩(wěn)定的細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容

Tet2基因，全稱為tet methylcytosine dioxygenase 2[Homo sapiens(human)]Gene ID:54790，其編碼的蛋白質(zhì)是催化甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶的甲基胞嘧啶雙加氧酶，編碼的蛋白質(zhì)參與髓細(xì)胞生成。通常負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)血細(xì)胞的形成，控制這些細(xì)胞的生長(zhǎng)。有研究證實(shí)，該基因的缺陷與數(shù)種骨髓增殖性疾病相關(guān)。其作用模式示于圖1。但對(duì)于Tet2基因在提高難生成單克隆的細(xì)胞在低接種密度下的體外增殖活力中的應(yīng)用目前尚未報(bào)道。