[發明專利]提高細胞產生單克隆的能力的方法

在審

• 申請號: 202011637383.5
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112662704A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 王琦
• 申請（專利權）人: 江蘇集萃醫學免疫技術研究所有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/53;C12N5/10
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 宋明

1.提高細胞(優選體外細胞)增殖能力的方法，包括：

通過基因編輯使所述細胞中的Tet2基因表達降低，不表達或功能缺失，獲得編輯細胞；

培養所述編輯細胞，并從該編輯細胞或其后代細胞中選擇具有能夠在較低的播種密度(例如，相當于96孔板中19.53cell/孔以下)生長的能力的細胞。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述基因編輯方法選自ZFN、TALEN技術、CRISPR-Cas9技術，優選為CRISPR-Cas9技術。

3.根據權利要求1或2所述的方法，包括使用選自如下的組中的一種或多種shRNA靶點：

shRNA1，其包含如SEQ ID NO:1所示的序列；

shRNA2，其包含如SEQ ID NO:2所示的序列；

shRNA3，其包含如SEQ ID NO:3所示的序列；

shRNA4，其包含如SEQ ID NO:4所示的序列；

shRNA5，其包含如SEQ ID NO:5所示的序列；和

shRNA6，其包含如SEQ ID NO:6所示的序列。

4.根據權利要求3所述的方法，包括使用針對所述shRNA靶點設計的引物，優選所述引物為：

TET2-shRNA-1F，其包含如SEQ ID NO:7所示的序列；

TET2-shRNA-1R，其包含如SEQ ID NO:8所示的序列；或

TET2-shRNA-2F，其包含如SEQ ID NO:9所示的序列；

TET2-shRNA-2R，其包含如SEQ ID NO:10所示的序列；或

TET2-shRNA-3F，其包含如SEQ ID NO:11所示的序列；

TET2-shRNA-3R，其包含如SEQ ID NO:12所示的序列；或

TET2-shRNA-4F，其包含如SEQ ID NO:13所示的序列；

TET2-shRNA-4R，其包含如SEQ ID NO:14所示的序列；或

TET2-shRNA-5F，其包含如SEQ ID NO:15所示的序列；

TET2-shRNA-5R，其包含如SEQ ID NO:16所示的序列；或

TET2-shRNA-6F，其包含如SEQ ID NO:17所示的序列；

TET2-shRNA-6R，其包含如SEQ ID NO:18所示的序列。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，包括通過選自梯度稀釋法、有限稀釋法、半固體培養基鋪板、流式細胞儀分選法中的一種或多種方法的組合進行選擇，

所述選擇包括篩選能在相當于96孔板中19.53cell/孔以下，例如10cell/孔以下，優選為1cell/孔；特別優選為0.5cell/孔的播種密度下長成單克隆的細胞，

優選，在選擇期間，在培養細胞的培養基中不含有除了血清以外的額外的生長因子或輔因子。

6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中所述細胞在進行編輯前，在以較低接種密度(例如在相當于96孔板中19.53cell/孔以下，例如10cell/孔以下)進行培養時不能形成克隆，或單克隆形成率較低，

所述細胞為哺乳動物或其他真菌、細菌的細胞，所述哺乳動物例如為人，大鼠，小鼠，豬，牛，馬，犬，綿羊，山羊，雞，鴨，猴，優選為人。

7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述細胞選自THP-1，Caco-2，SHY5Y，HMy2.CIR，HL-60。

8.權利要求1-7中任一項所述的方法中使用的載體，所述載體為哺乳動物細胞表達載體，如原核載體，真核載體，腺病毒載體或重組慢病毒載體，優選為重組慢病毒載體，例如lentiCRISPR v2(addgene#52961)、pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0(addgene#62988)、lentiGuide-Puro(addgene#52963)。