[發明專利]一種動物細胞核懸液的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 202011637365.7
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112662737B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 周煌凱;高川;陳飛欽;夏昊強;徐毓璇;梁國霞
• 申請（專利權）人: 廣州基迪奧生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06;C12N15/10
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

1.一種細胞核懸液的制備方法，其特征在于，包含如下過程：

S1、取45～55mg的目的組織，向其中加入450～550μL的裂解液，于冰上靜置4～6min，然后將組織剪成1～3mm³大小的碎片，得含裂解液的組織碎片；

S2、將步驟S1制得的含裂解液的組織碎片轉移至研磨管，迅速按壓1～2次，并于冰上靜置3～5min，制得組織液；

S3、將步驟S2制得的組織液按壓8～12次，于冰上靜置2～3min，再次按壓14～16次，并迅速轉移至新的離心管中，制得勻漿混合液；

S4、向步驟S3制得的勻漿混合液中加入450～550μL的重懸Buffer，來回顛倒5～8次，混合均勻，然后離心，將上清液轉移至15mL離心管中，制得新的勻漿液；

S5、將步驟S4制得的新的勻漿液離心，去除上清液，加入1～2mL重懸buffer充分重懸沉淀，連續重復2次，然后向其中加入碘克沙醇，吹打混勻，并向其中加入700μL重懸buffer，再次離心，并用移液槍去除雜質及上清液，保留下層液體；

S6、向步驟S5中的下層液體中加入1～2mL重懸buffer，輕柔吹吸混合均勻，然后離心去掉上清液，最后留180～220μL于離心管內，向其中加入450～550μL的重懸buffer，輕柔吹吸重懸，制得細胞懸液；

S7、將步驟S6制得的細胞懸液用細胞篩過濾，并向其中加入450～550μL的重懸buffer，離心，收集沉淀，然后用殺菌液清洗2次，離心，去掉上清液，向沉淀中加入預冷的1×PBS，并檢測其濃度，即得；步驟S1、S2所述的裂解液包括摩爾質量為250mM的蔗糖，摩爾質量為50mM的Tris-HCl，摩爾質量為50mM的CaCl₂，摩爾質量為50mM的MgCl₂，摩爾質量為1mM的DTT，質量百分數為0.1％的CA-630，酶活單位為0.4U/μL的RNase Inhibitor，質量濃度為0.04％的BSA，1×protease inhibitor；步驟S4、S5、S6及S7中所述的重懸buffer為含質量百分數為0.04％的BSA，終濃度為0.35M的甘露醇，活性為0.2U/μL的RNase Inhibitor的1×PBS；步驟S7所述的離心過程為于2600～2700rpm轉速下離心4～7min；所述殺菌液包含如下組分及其重量份數：金銀花粉5～10份，大蒜素3～5份，連翹提取物2～3份，雙純水50～60份。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S4所述的離心過程為于1600～1700rpm轉速下離心8～12s。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S5所述的離心過程為于2600～2700rpm轉速下離心4～6min；所述碘克沙醇的質量百分數為55～65％，加入量為液體總體積的0.6～0.8倍；所述再次離心時轉速為10000～12000rpm，離心時間為15～20min。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S6所述的離心過程為于2600～2700rpm轉速下離心5～8min。

5.一種利用權利要求1所述的制備方法在構建單細胞轉錄組測序文庫中的應用。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，將利用所述方法制備的細胞核懸液置于冰上，于30min內建庫。