[發明專利]一種生產重組亞硝酸鹽還原酶的方法

在審

• 申請號: 202011636221.X
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN113151333A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 方國康;汪本助;王舒;徐斌
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/06;C12N15/53;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京睿陽聯合知識產權代理有限公司 11758
• 代理人: 郭奧博;張穎

本發明涉及亞硝酸鹽還原酶的重組表達載體、具有所述重組表達載體的宿主細胞以及生產重組亞硝酸鹽還原酶的方法。本發明通過設計表達載體，實現重亞硝酸鹽還原酶的高效表達，再采用優化的純化方法對目標蛋白進行提純，大幅縮短了目標蛋白的純化流程與純化時間，同時提高了目標蛋白的純度、得率和酶活，節省實驗步驟并減少成本。本發明為研發與生產亞硝酸鹽還原酶類似的或者其他蛋白類工具酶奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種生產重組亞硝酸鹽還原酶的方法。

背景技術

亞硝酸鹽，是氮循環中無機結合氮的一種分子形態，其氮處于中間價態，酸性條件下具有較強的氧化性，在血液中可將血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，從而對高等動物體內氧的運輸有抑制作用。在體外，用亞硝酸鈉處理人紅細胞后，會引發紅細胞中酶和非酶介導的氧化應激，導致血紅蛋白失活聚集，脂質和蛋白質被氧化，且紅細胞內的主要代謝途徑亦發生改變。

自然界可利用生物類群對被污染的環境，如亞硝酸鹽污染，進行自凈化作用。生物體可利用體內的亞硝酸鹽還原酶(Nitrite reductase，NIR)把亞硝酸鹽還原為一氧化氮或氨。NIR廣泛存在于植物和微生物中，國內外的研究者們已經從植物、紅藻、細菌中分離并提純到亞硝酸鹽還原酶。早在1960s，Alcaligenes sp.，Neurospora crassa，Pseudomonassp.等亞硝酸鹽降解菌就從污水中被分離出來了。但關于能降解亞硝酸鹽的真菌的研究起步較晚，1995年，Kobayashi,M等首次從真菌Fusarium oxysporum中分離出NIR，后有多種真菌的Cu-NIRs被報道。

目前，常見的NIR生產方法，主要從產NIR的微生物中提取，該方法步驟繁瑣，蛋白獲取量低。因此，研發一種重組NIR在大腸桿菌中的生產方法，實現高純度重組NIR的制備，從而節省實驗步驟并減少成本，是非常有必要的。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供亞硝酸鹽還原酶的重組表達載體，具有所述重組表達載體的宿主細胞以及生產重組亞硝酸鹽還原酶的方法。

第一方面，本發明提供一種亞硝酸鹽還原酶的重組表達載體，所述重組表達載體是在pET-28a載體質粒中插入了編碼亞硝酸鹽還原酶的核苷酸序列。本發明可用pET-28a-NIR表示該重組表達載體。

本發明通過大量實踐發現，利用pET-28a載體質粒獲得的亞硝酸鹽還原酶的重組表達載體，可以實現亞硝酸鹽還原酶的高效表達。

在一些實施方式中，所述編碼亞硝酸鹽還原酶的核苷酸序列經過密碼子優化，以利于在宿主細胞中的表達。

在一些實施方式中，所述編碼亞硝酸鹽還原酶的核苷酸序列如

SEQ ID NO:1所示。