[發明專利]一種生產重組亞硝酸鹽還原酶的方法

在審

• 申請號: 202011636221.X
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN113151333A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 方國康;汪本助;王舒;徐斌
• 申請（專利權）人: 安徽豐原發酵技術工程研究有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/06;C12N15/53;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京睿陽聯合知識產權代理有限公司 11758
• 代理人: 郭奧博;張穎

1.亞硝酸鹽還原酶的重組表達載體，其特征在于，在pET-28a載體質粒中插入了編碼亞硝酸鹽還原酶的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的重組表達載體，其特征在于，所述編碼亞硝酸鹽還原酶的核苷酸序列經過密碼子優化；

優選地，所述編碼亞硝酸鹽還原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根據權利要求1或2所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體中還插入了編碼蛋白標簽的核苷酸序列，所述蛋白標簽優選為His標簽。

4.具有權利要求1～3任意一項所述重組表達載體的宿主細胞；

優選地，所述宿主細胞為大腸桿菌，更優選為BL 21(DE3)感受態細胞。

5.利用權利要求1～3任意一項所述重組表達載體或權利要求4所述宿主細胞生產重組亞硝酸鹽還原酶的方法。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將轉入了所述重組表達載體的宿主細胞，涂布于卡那霉素抗性的平板培養基上，培養過夜；

(2)挑取單菌落置于卡那霉素抗性的液體培養基中培養，加入誘導劑誘導蛋白表達，取誘導表達的菌液，離心收集菌體；

(3)在所述菌體中加入細胞裂解液進行裂解，離心取上清，純化。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述誘導劑為異丙基硫代半乳糖苷，所述誘導劑在培養體系中的濃度優選為0.05mM～0.15mM；

優選地，當培養體系的OD600nm達到0.6～0.8時加入所述誘導劑；和/或，誘導蛋白表達的溫度為10～15℃；和/或，誘導蛋白表達的時間為40～55h。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述細胞裂解液包含如下成分：濃度為15mM～25mM的三羥甲基氨基甲烷，濃度為280mM～320mM的氯化鈉，重量百分比為5～15％的甘油；所述細胞裂解液的pH為7.8～8.5。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述純化先經過親和層析，再經過凝膠過濾層析；

優選地，所述親和層析采用鎳柱；進行純化時，優選先采用含有10～30mM咪唑的洗脫液進行洗脫，然后含有400～600mM咪唑的洗脫液進行洗脫；

優選地，所述凝膠過濾層析為分子篩，更優選為Superdex200分子篩。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，進行凝膠過濾層析時，以目標蛋白的儲存液作為流動相，然后根據流分的紫外吸收值收集目標蛋白溶液；

優選地，所述紫外吸收值在275～285nm下檢測。