[發明專利]肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法及其應用

在審

• 申請號: 202011635557.4
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112779310A
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 王陽;柏旭
• 申請（專利權）人: 廈門市博瑞來醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 合肥市上嘉專利代理事務所(普通合伙) 34125
• 代理人: 李璐

1.一種肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：使用油酸鈉、維生素A類和羅格列酮的組合或油酸鈉、維生素A類、胰島素的組合使肝星狀細胞回復靜息狀態；

步驟2：分別用胎牛血清、TGF-β1、PDGFBB/AA、脂多糖或其任意組合共同誘導肝星狀細胞再次活化；同時加入待篩選化合物觀察某分子對誘導活化條件的抑制作用；

步驟3：用染料對肝星狀細胞進行染色，酶標儀讀取熒光或光吸收量進行定量分析；篩選待測藥物，根據活力選出候選活性藥物，用免疫印記或RT-PCR方法證實藥效。

2.根據權利要求1所述的肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法，其特征在于，在步驟1中，所述維生素A類替換為全反式維甲酸或RXR激動劑。

3.根據權利要求1所述的肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法，其特征在于，在步驟3中，根據活力選出候選活性藥物的方法是以化合物篩選濃度為0.2nM—200μM在化合物庫中篩選出能顯著抑制胎牛血清、TGF-β1、PDGFBB/AA、脂多糖或其任意組合誘導的膠原表達的化合物。

4.根據權利要求1至3任一項所述的肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

(1)鋪板：96孔板中人肝星狀細胞LX-2鋪2000—5000個細胞/well，10％FBS高糖DMEM100μl培養，人肝星狀細胞LX-2經胰酶消化，2000rpm 5min離心去上清，12ml培養基吹打、重懸，排槍每孔分100μl，每次吸取細胞后混勻；

(2)細胞貼壁后將培養基換成含有2％FBS的DMEM培養12—24h；

(3)回復靜息：吸出培養基，PBS洗一次(2min之內換培養基)，每孔加入含有50—500nMInsulin、0.1—10μM Vitamin A、0.5—2％FBS、1％雙抗和50—400μM油酸鈉-BSA的DMEM培養12—36h；

(4)激活-篩選：培養基含15—50μM油酸鈉-BSA、0.1—1μM Vitamin A,激活因子為cFBS或0.5—20ng/ml TGF-β或5—50ng/ml LPS或5—50ng/ml PDGFAA/BB或其組合，同時加入終濃度1—50μM的待篩選化合物，24或48h后吸出60μl培養基，緩慢加入150μl中性福爾馬林，4℃固定過夜；

(5)染色后檢測：完全棄去固定液，空氣中干燥，100μl PBS洗一次10min，采用比色定量或熒光定量分析，比色定量法得到的OD(620—650)nm/OD(480—495)nm或熒光定量法得到的Bodipy/Hoechst33342熒光強度代表相對脂滴含量，用來表征肝星狀細胞活化被抑制的程度，即待篩選化合物抑制HSC激活的藥效。

5.根據權利要求4所述的肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法，其特征在于，在步驟(5)中，采用比色定量分析的具體步驟包括：

經過油紅O(ORO)染色和亞甲基藍(MB)染色，60％異丙醇洗一次10min，每孔50μl ORO工作液染10—30min，棄去ORO染液，100μl PBS洗一次，150—200μl 50％異丙醇洗一次洗去孔壁上染料，甩干，每孔加入100μl去離子水，再加入50μl 0.01—0.05％亞甲基藍水溶液混勻，染色5—20min，棄上清并甩干；每孔加入無水乙醇50μl溶解5min避光，加入20—50mM稀鹽酸50μl，振蕩混勻；5min內492nm和620nm測吸光度，計算OD620/OD492。

6.根據權利要求4所述的肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法，其特征在于，在步驟(5)中，采用熒光定量分析的具體步驟包括：

經過Bodipy-Hoechst_33342染色，固定、干燥后的肝星狀細胞經100μl PBS洗2次，吸走50μl PBS，加入50μl的2X染液(PBS中含有2ng/ml—10μg/ml Bodipy493/503和1ng/ml—20μg/ml Hoechst33342)37℃避光染色20min，棄去染液，100μl PBS洗3次，酶標儀讀數H-350/461nm和B-490/510nM，計算B/H熒光強度。

7.一種利用如權利要求1至3任一項所述肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法在測定肝星狀細胞活化抑制的靶向藥物的藥效定量分析中的應用。