[發明專利]肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法及其應用

在審

• 申請號: 202011635557.4
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112779310A
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 王陽;柏旭
• 申請（專利權）人: 廈門市博瑞來醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 合肥市上嘉專利代理事務所(普通合伙) 34125
• 代理人: 李璐

本發明公開了一種肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法，包括以下步驟：步驟1：使用油酸鈉、維生素A類和羅格列酮的組合或油酸鈉、維生素A類、胰島素的組合使肝星狀細胞回復靜息狀態；步驟2：分別用胎牛血清、TGF?β1、PDGFBB/AA、脂多糖或其任意組合共同誘導肝星狀細胞再次活化；同時加入待篩選化合物觀察某分子對誘導活化條件的抑制作用；步驟3：用染料對肝星狀細胞進行染色，酶標儀讀取熒光或光吸收量進行定量分析；篩選待測藥物，根據活力選出候選活性藥物，并證實藥效。還公開了一種利用該方法在測定肝星狀細胞活化抑制的靶向藥物的藥效定量分析中的應用。本發明能夠對肝星狀細胞的活化狀態進行定量檢測。

技術領域

本發明涉及生物化學領域，特別是涉及一種肝星狀細胞活化抑制劑的高通量篩選方法及其應用。

背景技術

肝星狀細胞活化是肝纖維化過程中的關鍵環節，目前沒有針對肝星狀細胞激活環節進行抑制的靶向藥物。缺少對肝星狀細胞活化狀態的定量檢測方法，也導致了抑制劑藥效不容易衡量。

1、肝纖維化與肝星狀細胞活化

肝纖維化是機體的一個創傷修復反應，肝細胞損傷區域被大量的細胞外基質包裹HSC的激活為抗纖維化提供了潛在靶點治療肝纖維化。肝纖維化形成的過程經歷了：1)各種因素造成的肝損傷；2)因子(激活因素)釋放；3)肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化、增殖；4)膠原合成、分泌、修飾；5)細胞外膠原纖維積累和清除的過程，其中各個過程所涉及的具體機制都可以作為抗纖維化藥物的作用基礎。HSC是細胞外基質的主要來源，所以HSC活化是肝纖維化的中心事件。

肝臟星狀細胞占肝臟固有細胞總數的15％，占非實質細胞的30％左右。HSC存在于Disse腔中，呈梭形或多邊形，胞漿內有多個富含維生素A的脂滴(所以也稱儲脂細胞)，其細長的突起向外延伸環繞在血竇內皮細胞外面，是體內儲存視黃醛衍生物的首要部位。在正常肝臟中，星狀細胞處于靜止狀態，不表達α平滑肌肌動蛋白(α-SMA，ATCA2基因編碼)，增殖活性低，合成膠原能力低，其主要功能是貯存視黃醛類。在正常肝組織中HSC常處于靜息狀態。但是當肝臟受到物理、化學和微生物感染等病理因素刺激時HSC就會發生增殖活化轉變為其活化形式—肌成纖維樣細胞(MFB)，HSC激活后釋放脂滴(釋放維生素A)是肝內維持穩態的天然防御機制，肝臟細胞及體細胞、脂肪細胞攝取維生素A幫助FXR、PPARs完成生物學功能，例如減少肝細胞內脂質積累、使脂類代謝加快并重新分布于肝以外的器官；之后活化的HSC開始大量合成和分泌膠原表現出明顯的細胞增殖、收縮性增加、大量表達α-平滑肌動蛋白(α-SMA)。脂滴容易被油紅O染色(ORO染色，是脂滴染色的金標準)，所以從形態特征可以區分出靜息與活化狀態的HSC。

2、用熒光探針標記脂滴

脂滴(Lipid droplets,LDs)由磷脂單分子表層和中性脂內核組成，是細胞內中性脂的主要貯存場所，廣泛存在于多種動植物細胞中。近年來的研究發現，脂滴并非是一個“惰性”的能量貯存器，而是活躍的多功能細胞器，它的異常與肥胖、II型糖尿病、脂肪性肝病、高脂血癥和動脈粥樣硬化等疾病有著密切的聯系。因此，脂滴的檢測對生物醫學研究和臨床診斷具有重要意義。近年來，熒光檢測方法以其高靈敏性、高分辨率、操作簡單和價格低廉等特點逐漸成為生物醫學研究的重要研究手段。商業化的脂滴熒光染料主要有尼羅紅(Nile Red)和BODIPY系列化合物。尼羅紅因為雙發射波長不適用于基于熒光的篩選。但應用BODIPY時存在的問題是斯托克位移小，光穩定性不好。

從2001年聚集誘導發光(aggregation-induced emission，AIE)的提出至今，AIE被用于解決傳統熒光分子面臨的問題，AIE脂滴熒光探針便是其中的一個方面。相比傳統的商用熒光染料，AIE脂滴熒光探針在成像中具有亮度高、斯托克斯位移大和光穩定性好等優點，能滿足研究中細胞內脂滴的跟蹤與分析的要求。

3、新探針與HSC活化抑制劑篩選