[發明專利]一種含有蛋白的保護劑及間充質干細胞因子的保存方法

在審

• 申請號: 202011634825.0
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112625114A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 孫曉晨
• 申請（專利權）人: 瑞諾威德（杭州）醫學科技有限公司
• 主分類號: C07K14/475
• 分類號: C07K14/475;C12N5/0775
• 代理公司: 天津合正知識產權代理有限公司 12229
• 代理人: 邢月

1.一種含有蛋白的保護劑，其特征在于：該保護劑包含1-5g/L的大豆肽、1-5g/L的人參肽、0.5-1.5g/L的白蛋白、0.5-1.5g/L的谷胱甘肽、0.7-1.2g/L的谷氨酰胺、80-120IU/ML的表皮細胞生長因子與80-120IU/ML的成纖維細胞生長因子。

2.根據權利要求1所述的含有蛋白的保護劑，其特征在于：所述的保護劑包含1-5g/L的大豆肽、1-5g/L的人參肽、1-1.5g/L的白蛋白、1-1.5g/L的谷胱甘肽、1-1.2g/L的谷氨酰胺、80-120IU/ML的表皮細胞生長因子與80-120IU/ML的成纖維細胞生長因子。

3.一種間充質干細胞因子的保存方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)臍帶組織培養：將組織塊接種于培養瓶底部，然后添加培養液，培養7-8天后，組織塊周圍有成纖維狀細胞爬出，去除組織塊更換培養液繼續培養1-2天，培養得到的細胞為P0，將貼壁細胞轉移到其他培養瓶中培養，培養得到的細胞為P1；

(2)間充質干細胞傳代培養：將P1細胞傳代培養至P6，收集P2至P6細胞的培養上清液，在P2至P6細胞的培養基中加入權利要求1或2所述的保護劑，然后置于溫度為35-40℃、CO₂濃度為3-8％的條件下培養，培養至細胞融合度達到70-90％時，將細胞進行水浴熱激，然后在低壓氧倉中處理5-20分鐘，再放入低氧環境中處理5-20分鐘，然后取出繼續培養；

(3)間充質干細胞培養上清離心、純化和過濾除菌：將所述的步驟(2)中收集的培養上清液進行高速離心，收集離心后上清液進行濃縮、除菌；

(4)長效細胞因子的制備：在所述的步驟(3)中除菌后的濃縮液中加入權利要求1或2所述的保護劑，經充分混合后即成。

4.根據權利要求3所述的間充質干細胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步驟(1)中的培養液為含1％血清替代物的DMEM/F12。

5.根據權利要求3所述的間充質干細胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步驟(2)中的水浴熱激步驟的溫度為38-42℃，時間為5-15分鐘。

6.根據權利要求3所述的間充質干細胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步驟(2)中的低壓氧倉的壓力為10-12KPa；所述的步驟(2)中的低氧環境的氧氣濃度為15-18％。

7.根據權利要求3所述的間充質干細胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步驟(2)中的保護劑在P2至P6細胞的培養基的終濃度為1-5g/L；所述的步驟(4)中的保護劑在濃縮液中的終濃度為1-5g/L。

8.根據權利要求3所述的間充質干細胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步驟(3)中的離心步驟的轉速為3000-5000r/min，時間為20-30分鐘；所述的步驟(3)中的除菌后的上清液儲存于-20--80℃的條件下。

9.根據權利要求3所述的間充質干細胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步驟(3)中間充質干細胞培養上清離心、純化和過濾除菌的具體步驟為：將收集的培養上清液于室溫解凍，通過濾膜過濾掉參與細胞，然后超濾收集分子量在3-30KD的細胞因子的濃縮液，通過濾膜過濾除菌，將濃縮液收集。

10.根據權利要求3所述的間充質干細胞因子的保存方法，其特征在于：所述的步驟(4)中混合步驟后將得到的間充質干細胞因子溶液存儲于溫度為2-8℃的環境中。