[發明專利]一種重組枯草芽孢桿菌及谷胱甘肽的制備方法

在審

• 申請號: 202011631928.1
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112662720A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 韋建國;王德正;李志敏;劉世領
• 申請（專利權）人: 上海青平藥業有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12N1/21;C12N15/52;C12N15/75;C12N15/77;C12N15/66;C12R1/125;C12R1/15
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 汪青;周敏

本發明涉及一種重組枯草芽孢桿菌及谷胱甘肽的制備方法，采用過表達雙功能谷胱甘肽合成酶基因的枯草芽孢桿菌基因工程菌株發酵生產所述的谷胱甘肽，不僅谷胱甘肽產量高、得率高，而且操作簡單、方便，同時該方法以食品級枯草芽孢桿菌作為生產菌株，更加安全、可靠，為工業化綠色生產谷胱甘肽提供了有效的參考和借鑒。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種重組枯草芽孢桿菌及谷胱甘肽的制備方法。

背景技術

谷胱甘肽(γ-L-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸三種氨基酸縮合而成的一種活性三肽類化合物，廣泛存在于各種生物體內。還原型的谷胱甘肽在活組織中具有許多重要的功能，谷胱甘肽能夠提高人體免疫力，具有抗衰老的功效，其在老人遲緩化的細胞上所發揮的功效比年輕人大，谷胱甘肽對于治療放射線、放射性藥物所引起的白細胞減少等癥狀也都具有非常顯著的效果。

目前谷胱甘肽的制備方法很多，常見的包括溶劑萃取法、化學合成法、生物發酵法和酶法。目前國內外生產谷胱甘肽主要是是采用發酵法或酶法，發酵法主要是將編碼合成谷胱甘肽酶系或者雙功能酶的基因克隆到細菌或酵母中，發酵培養獲得谷胱甘肽，發酵法中酵母發酵法工藝較成熟。專利CN201810844388和CN201680013630分別在酵母和大腸桿菌中外源表達谷胱甘肽合成雙功能酶基因，達到發酵生產谷胱甘肽的目的，但是產量很低，不適合批量化生產。并且還原性谷胱甘肽在醫藥保健、食品化妝品等領域有著廣泛的應用，安全性至關重要，因此還需保證生產的谷胱甘肽足夠安全、可靠。

發明內容

本發明的目的是提供一種具有高產量、高得率的谷胱甘肽的制備方法。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案是：

本發明第一方面提供一種谷胱甘肽的制備方法，采用過表達雙功能谷胱甘肽合成酶基因的重組枯草芽孢桿菌基因工程菌株發酵生產所述的谷胱甘肽。

優選地，所述的雙功能谷胱甘肽合成酶基因為來源于Streptococcusthermophilus的gshFst基因，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發明中，所述的雙功能谷胱甘肽合成酶基因可通過常規基因工程手段獲得。例如可以Streptococcus thermophilus DNA為模板通過PCR擴增分離得到，也可根據其序列通過人工合成得到。

優選地，采用補料分批發酵法生產所述的谷胱甘肽。

優選地，生產所述的谷胱甘肽時添加谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸。

優選地，添加的所述的谷氨酸、所述的甘氨酸、所述的半胱氨酸在反應體系中的初始濃度分別為80～120mM，進一步優選為90～110mM，更優選為95～105mM。

本發明通過高密度培養以及過表達雙功能谷胱甘肽合成酶基因，將外援添加的谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸合成谷胱甘肽，從而達到高產量、高得率。

優選地，將所述的枯草芽孢桿菌基因工程菌接種至發酵培養基中進行發酵培養，在發酵培養的同時分批添加補料液，并控制發酵培養的溫度為35～40℃，pH為6.5～7.5，發酵培養至OD600為45～55；然后加入誘導劑繼續培養至OD600為60～70，再加入谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸，繼續培養至所述的谷胱甘肽的產量不再增加。

在本發明中，上述發酵培養過程中，發酵培養時間為25～35h，OD600達到45～55；加入誘導劑后繼續培養8～12h，OD600達到60～70。

在本發明中，谷氨酸棒桿菌基因工程菌擴大培養方法如下所示：

A.平板培養：將甘油管保存的谷氨酸棒桿菌基因工程菌接種至LB培養基中，30℃培養8-12h得到一級種子。