[發(fā)明專利]一種重組枯草芽孢桿菌及谷胱甘肽的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011631928.1
• 申請(qǐng)日: 2020-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112662720A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韋建國(guó);王德正;李志敏;劉世領(lǐng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海青平藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02;C12N1/21;C12N15/52;C12N15/75;C12N15/77;C12N15/66;C12R1/125;C12R1/15
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 汪青;周敏

1.一種谷胱甘肽的制備方法，其特征在于：采用過(guò)表達(dá)雙功能谷胱甘肽合成酶基因的重組枯草芽孢桿菌基因工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)所述的谷胱甘肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述的雙功能谷胱甘肽合成酶基因?yàn)閬?lái)源于Streptococcus thermophilus的gshFst基因，所述的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：采用補(bǔ)料分批發(fā)酵法生產(chǎn)所述的谷胱甘肽。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：生產(chǎn)所述的谷胱甘肽時(shí)添加谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸，且添加的所述的谷氨酸、所述的甘氨酸、所述的半胱氨酸在反應(yīng)體系中的初始濃度分別為80～120mM。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的制備方法，其特征在于：將所述的枯草芽孢桿菌基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵培養(yǎng)的同時(shí)分批添加補(bǔ)料液，并控制發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為35～40℃，pH為6.5～7.5，發(fā)酵培養(yǎng)至OD600為45～55；然后加入誘導(dǎo)劑繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為60～70，再加入谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸，繼續(xù)培養(yǎng)至所述的谷胱甘肽的產(chǎn)量不再增加。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：控制所述發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)的接種量為5％～20％。

7.一種重組枯草芽孢桿菌基因工程菌株的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)將來(lái)源于Streptococcus thermophilus的gshFst基因克隆到pHT-43質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒；

(2)將所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌，得到所述的谷氨酸棒桿菌基因工程菌。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于：所述的步驟(1)的具體方法為：以質(zhì)粒pET28a-gshFst為模板進(jìn)行DNA的擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物或質(zhì)粒采用BamHI和PstI進(jìn)行雙酶切，再與經(jīng)BamHI和PstI酶切處理后的所述的pHT-43質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到所述的重組質(zhì)粒。

9.一種重組枯草芽孢桿菌基因工程菌株，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌中過(guò)表達(dá)雙功能谷胱甘肽合成酶的基因，所述的枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis str.168。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的基因工程菌株，其特征在于：所述的雙功能谷胱甘肽合成酶基因?yàn)閬?lái)源于Streptococcus thermophilus的gshFst基因，所述的基因序列如SEQ IDNO.1所示。