[發明專利]一種尿液中修飾核苷及肌酐同時測定的方法

在審

• 申請號: 202011631690.2
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112858499A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 宋東奎;常琦;袁航;張莉蓉;常磊;魏曉松;樊鑫;陶晉;馬琦岳
• 申請（專利權）人: 鄭州大學第一附屬醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/60;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/72
• 代理公司: 鄭州亦鼎知識產權代理事務所(普通合伙) 41188
• 代理人: 張夏謙

本發明涉及液相質譜聯用技術領域，公開了一種尿液中修飾核苷及肌酐同時測定的方法，具體包括以下步驟：(1)尿樣預處理制備得到待測樣本；(2)待測混合標準溶液制備：稱取修飾核苷標準品和肌酐標準品，溶解稀釋得到不同濃度的標準溶液；稱取同位素內標物，溶解稀釋得到一定濃度的內標溶液；將上述標準品溶液與內標溶液進行混合得到待測混合標準溶液；(3)將待測樣本和待測混合標準溶液進行液質聯用檢測，得到修飾核苷的種類和含量；本發明提供的檢測方法中，通過將尿樣進行蛋白沉淀和稀釋，能夠有效的對尿液中的修飾核苷和肌酐進行同時的定性和定量分析。該方法無需復雜的前處理，大大簡化了樣品前處理的步驟，有效提高肌酐檢測靈敏度，有效避免個體樣本差異引起的測定誤差，極大的提高了修飾核苷定量的準確性。

技術領域

本發明涉及液相質譜聯用技術領域，具體涉及一種尿液中修飾核苷及肌酐同時測定的方法。

背景技術

近年，關于尿液修飾核苷在腫瘤標志物的研究中頗多，在正常細胞中修飾核苷比較穩定，它不像未修飾的核苷會經過再利用通道重新生成RNA或者被各種水解酶水解成尿酸，β-氨基丙酸，β-氨基異丁酸等，而是直接分泌到體外，因此正常成年人個體間核苷排放濃度差異較小，濃度分布在較窄的范圍。而在腫瘤發生和發展的過程中，RNA修飾酶高度活躍，且tRNA代謝速率遠高于正常細胞，修飾核苷大量排泄到體液中，惡性腫瘤中的tRNA明顯區別于正常組織的tRNA,表現為其修飾的核苷種類較多。因此尿中修飾核苷的含量基本反映了tRNA的代謝速度，因而成為多種腫瘤診斷和監測的潛在信號，例如，乳腺癌，頭頸癌，胃癌，食道癌，結直腸癌等。

目前，已有報道采用液質聯用的方法在分析前需要對尿液中的修飾核苷進行固相萃取，再進行檢測。除此之外，肌酐能夠標準化各種排泄化合物的水平，腎臟功能損傷不嚴重時，尿液中肌酐的排泄較少受尿液稀釋以及濃縮的影響，因此通常用尿液中肌酐含量作為尿中其他物質排泄的參照物，而已經報道過的文獻是基于堿性苦味酸分光光度計法或者高效液相色譜法對尿液中的肌酐進行定量，需要分開檢測修飾核苷和肌酐，過程過于繁瑣，耗費時間，因此需要一種前處理操作簡單、檢測高效且同時分析尿液修飾核苷和肌酐的方法。該檢測方法基于多反應監測MRM模式，通過內標法對尿液修飾核苷和肌酐定量，以尿液修飾核苷與肌酐的濃度比來作為尿樣中修飾核苷的最終含量(nmol/μmol Cr)。

現有技術存在尿液中的修飾核苷需進行富集、肌酐檢測靈敏度不高、人體樣本差異導致測量誤差較大等不足。

發明內容

本發明的目的在于提供一種尿液中修飾核苷和肌酐同時檢測新方法。本發明針對需要對尿液中的修飾核苷進行富集、肌酐檢測靈敏度不高、人體樣本差異導致測量誤差較大等現有技術的不足，本發明提供了一種尿液中修飾核苷及肌酐的同時檢測方法，具體包括如下步驟：尿液去除蛋白后稀釋，采用液質聯用技術，實現尿液樣本中修飾核苷和肌酐的同時定性和定量檢測。

本發明提供的尿液中修飾核苷及肌酐的同時檢測方法，包括以下步驟：

(1)尿樣預處理制備得到待測樣本；

(2)待測混合標準溶液制備：稱取修飾核苷標準品和肌酐標準品，溶解稀釋得到不同濃度的標準溶液；稱取同位素內標物，溶解稀釋得到一定濃度的內標溶液；將上述標準品溶液與內標溶液進行混合得到待測混合標準溶液；

(3)將待測樣本和待測混合標準溶液進行液質聯用檢測，得到修飾核苷的種類和含量；

任選的，步驟(1)待測樣本中還可以加入內標物。

其中，修飾核苷標準品包括但不限于腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、肌苷(I)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基胞苷(m5C)、3-甲基胞苷(m3C)、5-甲基尿苷(m5U)、3-甲基尿苷(m3U)、N,N-二甲基鳥苷(m²₂G)、假尿嘧啶核苷(Psu)、尿苷(U)、1-甲基鳥苷(m1G)、1-甲基腺苷(m1A)、6-O-甲基鳥苷(O6-MeG)、1-甲基次黃苷(m1I)、N4-乙酰胞苷(ac4C)和肌酐(Cr)等。