[發明專利]一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法

在審

• 申請號: 202011631663.5
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112626184A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 李赟;劉文蘭
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院（深圳市轉化醫學研究院）
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法。該檢測方法包括以下步驟：提取樣本中的DNA；將DNA通過重亞硫酸鹽處理，并純化回收；以重亞硫酸鹽處理的DNA為模板，利用SEQ ID NO.1?2所示引物進行PCR擴增；將PCR擴增產物進行蝦堿性磷酸酶反應；將堿性磷酸酶反應產物進行轉錄酶切反應，并樹脂純化；將樹脂純化產物進行核酸飛行時間質譜的分析，根據是否出現甲基化峰判斷是否出現，判斷是否出現甲基化，通過計算甲基化峰值與未甲基化峰值的比值，計算甲基化水平。本發明的檢測方法具備了操作簡單，檢測周期短，通量高，特異性高以及低污染風險等優勢。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法。

背景技術

MGMT基因在腦膠質瘤組織中表達與腫瘤細胞對亞硝脲類藥物的耐藥密切相關，并影響腫瘤的化療效果和病人的預后。在許多腫瘤中發現MGMT啟動子區過甲基化而導致MGMT基因的轉錄失活，表達量下降，在腦膠質瘤的研究發現，MGMT甲基化導致的基因沉默與替莫唑胺療效相關，MGMT基因啟動甲基化程度越高，使用替莫唑胺藥物療效越好。

目前市面上檢測甲基化的技術主要有熒光PCR、數字PCR、焦磷酸測序、基因芯片及二代測序等技術。其中焦磷酸測序方法是目前公認的金標準，但該檢測方法檢測的通量低(1-5CpG位點)，用的是化學染料來實現檢測，故其靈敏度和特異性相對較差；市面上應用最廣泛的熒光PCR方法除了上述缺點外，其檢測結果只能定性不能是實現定量；數字PCR檢測方法在熒光PCR的技術上實現了單分子PCR方法來進行核酸定量，雖然可以絕對定量，但依舊依賴于化學染料，故其檢測通量低、特異性差。基因芯片和二代測序技術雖然通量、靈敏度及特異性高，但其檢測成本高、且操作復雜，結果分析需要專業的生物信息學人員進行分析。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供了一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法，該方法操作簡單，且高通量自動化、特異性高。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法，包括以下步驟：

S1、提取樣本中的DNA；

S2、將DNA通過重亞硫酸鹽處理，并純化回收；

S3、以重亞硫酸鹽處理的DNA為模板，進行PCR擴增；PCR反應的體系為：

模板：2-2.1μl；

HPLC-grade water：2.82-2.84μl；

10×PCR buffer with 20mM MgCl₂：0.98-1.02μl；

25mM dNTP：0.08-0.09μl；

5U/uL的HotStarTaq Polymerase Enzyme：0.07-0.08μl；

1uM的上、下游引物各2μl；

總體積為8.00μl；

S4、將PCR擴增產物進行蝦堿性磷酸酶反應；

S5、將堿性磷酸酶反應產物進行轉錄酶切反應，并樹脂純化；

S6、將樹脂純化產物進行核酸飛行時間質譜的分析，根據是否出現甲基化峰，判斷是否出現甲基化，通過計算甲基化峰值與未甲基化峰值的比值，計算甲基化水平。

進一步的，所述樣本為膠質瘤石蠟組織切片，且腫瘤細胞含量70％。

更進一步的，S3中，上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。