[發明專利]一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法

在審

• 申請號: 202011631663.5
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112626184A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 李赟;劉文蘭
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院（深圳市轉化醫學研究院）
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 崔瑞迎

1.一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、提取樣本中的DNA；

S2、將DNA通過重亞硫酸鹽處理，并純化回收；

S3、以重亞硫酸鹽處理的DNA為模板，進行PCR擴增；PCR反應的體系為：

模板：2-2.1μl；

HPLC-grade water：2.82-2.84μl；

10×PCR buffer with 20mM MgCl₂：0.98-1.02μl；

25mM dNTP：0.08-0.09μl；

5U/uL的HotStarTaq Polymerase Enzyme：0.07-0.08μl；

1uM的上、下游引物各2μl；

總體積為8.00μl；

S4、將PCR擴增產物進行蝦堿性磷酸酶反應；

S5、將堿性磷酸酶反應產物進行轉錄酶切反應，并樹脂純化；

S6、將樹脂純化產物進行核酸飛行時間質譜的分析，根據是否出現甲基化峰，判斷是否出現甲基化，通過計算甲基化峰值與未甲基化峰值的比值，計算甲基化水平。

2.根據權利要求1所述的一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法，其特征在于，所述樣本為膠質瘤石蠟組織切片，且腫瘤細胞含量70％。

3.根據權利要求2所述的一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法，其特征在于，S3中，上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。

4.根據權利要求3所述的一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法，其特征在于，PCR反應的程序為：95℃，15min；95℃，20s，62℃，30s，72℃，1min，10個循環；95℃，20s，61.8*℃，30s，72℃，1min，40個循環；72℃，5min；15℃保持；*標識的該步驟每經歷一個循環將降低0.2℃。

5.根據權利要求4所述的一種檢測MGMT基因啟動子甲基化狀態的方法，其特征在于，S6中，將S5的純化產物放置在MassARRAY^TMRS 1000自動點樣儀中，放入SpectroCHIP芯片，進行自動化點樣，將純化產物點樣到芯片上，將點樣芯片放入核酸飛行時間質譜儀檢測，并生成結果。