[發明專利]一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法

在審

• 申請號: 202011631346.3
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112834737A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 姚應濤;田天;田根根
• 申請（專利權）人: 佳維斯（武漢）生物醫藥有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 陳凱

本發明提出了一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，包括步驟如下：固定，預處理，透明化處理，封閉液封閉，凍融和一抗孵育，二抗孵育，本發明采用凍融和超聲波孵育，增加光學透明劑的滲透率和熒光蛋白兼容性，從而增加熒光圖像的分辨率，實現大組織樣本的滲透性，從而達到器官的整體免疫標記。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法。

背景技術

免疫熒光技術利用了抗原與抗體高度特異性結合的原理，將某種可測定的物質偶聯到抗體或者抗原上，通過檢測標記物的有無和含量，對樣品中待檢抗原或抗體進行定性、定位和定量檢測。尤其近三十幾年來，免疫熒光技術是標記免疫技術中發展最快、應用最廣的一項技術，具有特異性強、靈敏度高、檢測速度快和便于觀察等優點。

針對熒光探針標記的生物組織進行光學成像時，目前已有的物理層析技術主要有兩種：一種是光學層析技術，通過光學方法抑制焦面以外的熒光從而提高z向分辨率，光學層析技術的主要限制在于其z向分辨率較低，并且光學層析技術采用點掃描模式，對于多色熒光探針標記的生物組織，掃描時間較長；另一種是機械層析技術，通過將生物組織包埋在樹脂中，通過物理切片的方式產生組織薄片，再對組織薄片進行寬場成像，物理層析技術的主要限制在于通過這種方法進行成像的過程中，組織薄片容易丟失，操作復雜，耗時較長，得到的圖像，其后期處理及三維配準非常困難，無法用于大體積的生物組織。

熒光標記生物組織，具有如下的優勢：發光效率高、穩定不易被淬滅、應用范圍廣并能夠展示更多的神經精細結構。但是現有技術的物理層析技術存在光學透明劑的滲透率低，熒光蛋白兼容性差導致圖像分辨率低不能顯示組織完整的熒光圖像。

發明內容

有鑒于此，本發明提出了一種提高光學透明劑的滲透率，形成清晰完整的熒光圖像的一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法。

本發明的技術方案是這樣實現的：本發明提供了一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，步驟如下：

S1，固定，將生物組織采用4％的PFA溶液固定，固定后采用PBS緩沖液清洗2-3次，每次1-2小時；

S2，預處理，固定處理后的生物組織采用體積分數為10％、30％、50％、70％、90％和100％的四氫呋喃溶液進行梯度脫水處理，每個濃度處理1-2小時；

S3，透明化處理，將預處理后的生物組織進行打孔處理，然后加入透明劑，在37℃的條件下，孵育1-2天；

S4，封閉液封閉，在透明化處理后的生物組織中加入封閉液，在37℃搖床浸泡條件下封閉8-12小時，封閉完成后，離心去液體，用PBS溶液清洗3-5次，每次2-3小時；

S5，凍融，封閉處理后的生物組織浸入冷凍保存液中，以0.1-0.5℃/分鐘的速度下降至-70～-80℃，保持30分鐘后，緩慢解凍至溫度10-20℃；

S6，一抗孵育，在超聲波反應器中加入用稀釋液稀釋300-500倍的一抗，然后在37℃、避光、超聲波條件下孵育解凍后的生物組織10-15天，孵育結束后用稀釋液清洗3-5次，每次8-10小時；

S7，二抗孵育，一抗孵育后，在超聲波反應器中加入用稀釋液稀釋500-800倍的帶有熒光染料分子的二抗，在37℃、避光、超聲波條件下孵育生物組織5-7天，然后用稀釋液清洗2-3次，每次8-10小時，獲得熒光標記的生物組織。

在以上技術方案的基礎上，優選的，步驟S3所述透明劑pH值為7.5-8.5，包括質量分數2％-3％的尿素、體積分數為20％-30％的DMSO、質量分數2％-5％的蔗糖、質量分數3％-5％的SDS、質量分數1％-3％的谷胱甘肽和質量分數0.02％-0.05％的疊氮化鈉和PBS緩沖液。

在以上技術方案的基礎上，優選的，步驟S4所述封閉液為PBS緩沖液、tritonx-100和血清。