[發明專利]一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法

在審

• 申請號: 202011631346.3
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112834737A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 姚應濤;田天;田根根
• 申請（專利權）人: 佳維斯（武漢）生物醫藥有限公司
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 陳凱

1.一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，其特征在于，步驟如下：

S1，固定，將生物組織采用4％的PFA溶液固定，固定后采用PBS緩沖液清洗2-3次，每次1-2小時；

S2，預處理，固定處理后的生物組織采用體積分數為10％、30％、50％、70％、90％和100％的四氫呋喃溶液進行梯度脫水處理，每個濃度處理1-2小時；

S3，透明化處理，將預處理后的生物組織進行打孔處理，然后加入透明劑，在37℃的條件下，孵育1-2天；

S4，封閉液封閉，在透明化處理后的生物組織中加入封閉液，在37℃搖床浸泡條件下封閉8-12小時，封閉完成后，離心去液體，用PBS溶液清洗3-5次，每次2-3小時；

S5，凍融，封閉處理后的生物組織浸入冷凍保存液中，以0.1-0.5℃/分鐘的速度下降至-70～-80℃，保持30分鐘后，緩慢解凍至溫度10-20℃；

S6，一抗孵育，在超聲波反應器中加入用稀釋液稀釋300-500倍的一抗，然后在37℃、避光、超聲波條件下孵育解凍后的生物組織10-15天，孵育結束后用稀釋液清洗3-5次，每次8-10小時；

S7，二抗孵育，一抗孵育后，在超聲波反應器中加入用稀釋液稀釋500-800倍的帶有熒光染料分子的二抗，在37℃、避光、超聲波條件下孵育生物組織5-7天，然后用稀釋液清洗2-3次，每次8-10小時，獲得熒光標記的生物組織。

2.如權利要求1所述的一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，其特征在于，步驟S3所述透明劑pH值為7.5-8.5，包括質量分數2％-3％的尿素、體積分數為20％-30％的DMSO、質量分數2％-5％的蔗糖、質量分數3％-5％的SDS、質量分數1％-3％的谷胱甘肽和質量分數0.02％-0.05％的疊氮化鈉和PBS緩沖液。

3.如權利要求1所述的一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，其特征在于，步驟S4所述封閉液為PBS緩沖液、tritonx-100和血清，PBS緩沖液∶tritonx-100∶血清的體積比為100∶(3-5)∶(2-3)。

4.如權利要求1所述的一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，其特征在于，步驟S5所述冷凍保存液為甘油和PBS緩沖液，甘油∶PBS緩沖液的體積比為(3-5)∶100。

5.如權利要求1所述的一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，其特征在于，步驟S6所述超聲波的功率密度為0.1-5.0W/cm²。

6.如權利要求1所述的一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，其特征在于，步驟S6所述稀釋液為PBS緩沖液和吐溫20，PBS緩沖液∶吐溫20的體積比為100∶(2-5)。

7.如權利要求1所述的一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，其特征在于，步驟S6所述一抗是anti-mTOR、anti-β-ⅢTubulin、anti-NeuN、anti-Ⅱcollagen抗體中的一種；步驟S7所述二抗是能夠與一抗特異性結合的免疫球蛋白，其攜帶熒光標記。

8.如權利要求1所述的一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，其特征在于，所述生物組織預處理后還包括對生物組織中的骨組織進行脫鈣處理。

9.如權利要求8所述的一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，其特征在于，所述脫鈣處理步驟為：生物組織經過脫水處理后，浸入0.01-0.1mol/L的EDTA-Na的溶液中5-8天，然后用PBS溶液2-3次，每次1-2小時。

10.如權利要求1-9任一所述的一種用于整體組織樣本的精準免疫熒光標記方法，其特征在于，生物組織為完整的腦組織、胚胎組織、腎臟組織、脊柱組織、肝臟組織、腸道組織和卵巢組織中的一種。