[發明專利]一種軟骨細胞的體外培養方法

在審

• 申請號: 202011629268.3
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112574947A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 張曉南;吳芳春;谷涌泉;侍曉云;張斌
• 申請（專利權）人: 北京昱龍盛世生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 李佳佳

本發明公開了一種軟骨細胞的體外培養方法，包括以下步驟：關節表面削下軟骨組織片，在添加了雙抗的PBS中，反復清洗；將清洗過后的軟骨組織置于培養基中，將軟骨組織切成碎片，再用含雙抗的PBS充分沖洗切碎的軟骨組織；收集切碎的軟骨組織離心，加入消化液，消化；離心收集細胞，加入PBS清洗細胞，在細胞團中加入培養液制成細胞懸液，計數細胞，調節細胞密度；接種，加入FBS的低糖DMEM培養基，再放置于飽和濕度培養箱中培養；細胞融合并覆蓋瓶底80％～90％時，即可傳代培養。本申請最大限度地解決了現有技術中細胞活率低、分離數量少、可保存性差的缺陷和不足，以該方法培養獲得的乳腺上皮細胞比傳統實驗室方法獲得的細胞活力更高，數量更多、更易貼壁。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，特別是一種軟骨細胞的體外培養方法。

背景技術

骨關節炎是一種慢性退行性骨關節病，多發于老年人，大部分以膝關節退變為主，其中軟骨細胞的死亡又是軟骨退行性病變的關鍵。關節軟骨是一種白色的高密度結締組織，連接著關節，充當接頭的承重材料，具有良好的摩擦、潤滑和磨損特點。由于關節軟骨周圍缺乏淋巴、血管、神經，其周圍軟骨細胞不能迅速增殖，軟骨損傷后不能自我修復，軟骨細胞埋藏在軟骨間質內，它所存在的部位為一小腔，稱為軟骨陷窩，廣泛存在于關節結締組織中，但軟骨細胞在體外通過相對適宜的環境可迅速增殖、分泌細胞外基質，為修復損傷的軟骨提供原材料。

由于軟骨細胞和軟骨屬于增殖能力極弱的終末未分化細胞，缺乏再生能力，所以自身修復甚為困難。傳統的自體軟骨移植術和異體軟骨移植可取得一定的治療效果，但由于軟骨來源及數量有限，難以滿足修復損傷軟骨，就目前而言，利用體外軟骨細胞培養修復損傷軟骨越來越受到青睞。

軟骨細胞作為軟骨組織中唯一細胞成分，是軟骨組織移植工程中一個重要來源，是體外軟骨細胞移植術的關鍵，所以軟骨細胞的取材和培養相當重要，但目前對軟骨細胞的體外培養尚不成熟。因此，探索一種能提高軟骨細胞活性和增殖能力的體外培養方法，已成為本領域技術人員急需解決的技術問題。

發明內容

針對上述現有技術存在的問題，本發明提供一種軟骨細胞的體外培養方法，培養速度快，耗時短，操作簡單，細胞活率高，細胞形態整齊、增殖旺盛，為科研領域提供一種全新的培養方法。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種軟骨細胞的體外培養方法，包括以下步驟：

步驟(1)、清洗關節組織后，從關節表面削下軟骨組織片，在添加了雙抗的PBS中，反復清洗至無明顯的血紅色、污漬以及可能誤帶的滑膜組織；

步驟(2)、將清洗過后的軟骨組織置于培養基(可以為基礎培養基)中，然后在培養基中用鑷子和十字刀片將軟骨組織切成碎片，再用含雙抗的PBS充分沖洗切碎的軟骨組織；

步驟(3)、收集切碎的軟骨組織離心，棄上清，加入消化液，培養箱中靜置過夜或采用分階段消化，直至軟骨組織基本消失，溶液變得混沌為止；

步驟(4)、離心收集細胞，加入PBS清洗細胞，在細胞團中加入培養液制成細胞懸液，計數細胞，調節細胞密度；

步驟(5)、接種，加入FBS的低糖DMEM培養基，再放置于飽和濕度培養箱中培養；

步驟(6)、細胞融合并覆蓋瓶底80％～90％時，即可傳代，消化，傳代培養；

所述步驟(1)-步驟(6)按照順序依次進行。

優選的是，步驟(1)的PBS中添加了3-5％雙抗，清洗3-5次。

上述任一方案中優選的是，步驟(1)的PBS中添加3％雙抗。

上述任一方案中優選的是，步驟(1)的PBS中添加4％雙抗。

上述任一方案中優選的是，步驟(1)的PBS中添加5％雙抗。