[發明專利]一種軟骨細胞的體外培養方法

在審

• 申請號: 202011629268.3
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112574947A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 張曉南;吳芳春;谷涌泉;侍曉云;張斌
• 申請（專利權）人: 北京昱龍盛世生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 李佳佳

1.一種軟骨細胞的體外培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟(1)、清洗關節組織后，從關節表面削下軟骨組織片，在添加了雙抗的PBS中，反復清洗至無明顯的血紅色、污漬以及可能誤帶的滑膜組織；

步驟(2)、將清洗過后的軟骨組織置于培養基中，然后在培養基中用鑷子和十字刀片將軟骨組織切成碎片，再用含雙抗的PBS充分沖洗切碎的軟骨組織；

步驟(3)、收集切碎的軟骨組織離心，棄上清，加入消化液，培養箱中靜置過夜或采用分階段消化，直至軟骨組織基本消失，溶液變得混沌為止；

步驟(4)、離心收集細胞，加入PBS清洗細胞，在細胞團中加入培養液制成細胞懸液，計數細胞，調節細胞密度；

步驟(5)、接種，加入FBS的低糖DMEM培養基，再放置于飽和濕度培養箱中培養；

步驟(6)、細胞融合并覆蓋瓶底80％～90％時，即可傳代，消化，傳代培養；

所述步驟(1)-步驟(6)按照順序依次進行。

2.根據權利要求1所述的一種軟骨細胞的體外培養方法，其特征在于，步驟(1)的PBS中添加了3％-5％雙抗，清洗3-5次。

3.根據權利要求1所述的一種軟骨細胞的體外培養方法，其特征在于，步驟(2)中在培養基中用鑷子和十字刀片將軟骨組織切成小于1mm³大小碎片，再用含3-5％雙抗的PBS充分沖洗切碎的軟骨組織。

4.根據權利要求1所述的一種軟骨細胞的體外培養方法，其特征在于，步驟(3)中分階段消化，即每消化1h就用40μm細胞濾網過濾，離心一次，將分離后的軟骨細胞放入培養液中保存起來，這樣反復進行，直至所有軟骨組織片消化完全。

5.根據權利要求1所述的一種軟骨細胞的體外培養方法，其特征在于，步驟(3)中收集切碎的軟骨組織500r/min離心5分鐘，棄上清，按組織塊與消化液的體積比例為1：10的量加入消化液，放置于37℃的培養箱中靜置過夜，期間可予移液槍吹打軟骨3-5次。

6.根據權利要求1所述的一種軟骨細胞的體外培養方法，其特征在于，步驟(4)中，以1500r/min離心10min收集細胞，棄上清，加入PBS清洗細胞，清洗2次，以除去消化液的殘留以及部分細胞碎片。

7.根據權利要求1所述的一種軟骨細胞的體外培養方法，其特征在于，步驟(5)中，以1*10⁵-1*10⁶個/ml的密度接種，放置于37℃、5％CO²的飽和濕度培養箱中培養。

8.根據權利要求1所述的一種軟骨細胞的體外培養方法，其特征在于，步驟(5)中，加入含9％-11％FBS的低糖DMEM培養基。

9.根據權利要求1所述的一種軟骨細胞的體外培養方法，其特征在于，步驟(6)中，細胞融合并覆蓋瓶底80％～90％時，即可傳代，去除培養液，用PBS清洗3次后，用質量分數為0.1-0.15％胰蛋白酶消化，按1∶2比例進行傳代培養。

10.根據權利要求1所述的一種軟骨細胞的體外培養方法，其特征在于，原代消化液中含有0.1％-0.15％胰蛋白酶，0.15％-0.25％膠原酶II，傳代消化液中含有0.1％-0.15％胰蛋白酶，0.015％-0.025％EDTA。