[發明專利]一種基因修飾的牙髓干細胞及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011627921.2
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112626031B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 王華;董曦文;魯茁壯;楊月峰;吳祖澤
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/861;C12N15/16;C12N15/12;C12N15/19;A61K35/28;A61K48/00;A61P25/28
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 董大媛

本發明提供了一種基因修飾的牙髓干細胞及其制備方法和應用，屬于脊髓損傷治療技術領域，所述牙髓干細胞過表達骨橋蛋白、胰島素樣生長因子1和睫狀神經營養因子；制備方法包括：1)將骨橋蛋白、胰島素樣生長因子1和睫狀神經營養因子的基因克隆到穿梭質粒pUC57中，獲得重組質粒pUC57?Syn；2)將所述重組質粒pUC57?Syn和骨架質粒pKAd5f11pES?PmeI分別酶切、Gibson組裝后的組裝產物電轉染細胞后獲得重組腺病毒Ad?OIC；3)將所述重組腺病毒Ad?OIC感染牙髓干細胞獲得基因修飾的牙髓干細胞。本發明提供的基因修飾的牙髓干細胞能夠改善脊髓損傷炎癥微環境，達到治療脊髓損傷的效果。

技術領域

本發明屬于脊髓損傷治療技術領域，尤其涉及一種基因修飾的牙髓干細胞及其制備方法和應用。

背景技術

脊髓損傷(SCI)患者會發生永久性的機體運動和感覺功能障礙，且臨床上缺乏行之有效的治療方法。脊髓損傷按照病理生理可分為原發性損傷和繼發性損傷，原發性損傷是由各種外力對脊髓造成的直接損傷，在發生瞬間已經形成，表現為血管損傷及神經細胞、膠質細胞等大量死亡。繼發性損傷則是由于這些細胞死亡所導致的缺血再灌注、炎癥反應、離子紊亂、毒性物質的釋放等構成更為嚴重的損傷過程。繼發性損傷對SCI疾病加重至關重要，也是目前各種臨床干預措施的重點。及早針對繼發性損傷進行干預，能有效減緩SCI的惡化，減輕脊髓損傷狀況以及遠期的致殘程度，利于SCI患者神經功能的后期恢復。

脊髓損傷后，多種免疫細胞和免疫分子被活化，這些炎癥細胞(如巨噬細胞，中性粒細胞等)及炎癥因子(如TNF-α及IL-1β)產生毒性作用，抑制脊髓內殘余神經元再生。同時，損傷微環境中的多種分子如髓鞘相關的抑制蛋白(Nogo,MAG,Omgp)、硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPGs)及軸突導向分子(semaphorins,ephrins)等，也可通過不同的信號途徑抑制神經元的軸突再生。因此，控制損傷后炎性環境，構建適宜神經元再生修復的微環境對SCI治療至關重要。

細胞治療是脊髓損傷修復的有效途徑，目前應用于治療脊髓損傷的主要是干細胞，包括胚胎干細胞、間充質干細胞、神經干細胞/神經前體細等；但是治療效果并不理想。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種基因修飾的牙髓干細胞及其制備方法和應用；本發明以牙髓干細胞(DPSCs)作為重塑脊髓損傷微環境的載體細胞，通過在牙髓干細胞中過表達OPN、IGF-1和CNTF基因，改善脊髓損傷炎癥微環境，促進神經修復和再生，實現改善脊髓損傷后的機體運動功能，達到治療脊髓損傷的效果。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：

本發明提供了一種基因修飾的牙髓干細胞，所述牙髓干細胞過表達骨橋蛋白、胰島素樣生長因子1和睫狀神經營養因子。

優選的，所述骨橋蛋白、胰島素樣生長因子1和睫狀神經營養因子的基因的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示。

本發明提供了所述的牙髓干細胞的制備方法，包括以下步驟：

1)將骨橋蛋白、胰島素樣生長因子1和睫狀神經營養因子的基因克隆到穿梭質粒pUC57的多克隆位點，獲得重組質粒pUC57-Syn；

2)將所述重組質粒pUC57-Syn和骨架質粒pKAd5f11pES-PmeI分別酶切、Gibson組裝后的組裝產物電轉染細胞后獲得重組腺病毒Ad-OIC；

3)將所述重組腺病毒Ad-OIC感染牙髓干細胞獲得基因修飾的牙髓干細胞。

優選的，步驟1)中所述骨橋蛋白的基因克隆至穿梭質粒pUC57的BglII和SalI酶切位點之間；所述睫狀神經營養因子和胰島素樣生長因子1的基因順次連接后克隆至穿梭質粒pUC57的KpnI和AgeI酶切位點之間。