[發明專利]一種GAS樣基序突變的PCV2毒株及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011626875.4
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112725291B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 黃勇;童德文;韓聰;杜謙;朱磊
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/34;C12N5/071;C12R1/93
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發明公開了一種GAS樣基序突變的PCV2毒株及其制備方法和應用。對PCV2DNA中的GAS樣基序進行突變，使得突變的PCV2DNA在病毒復制中不能與STAT5蛋白結合，并通過病毒拯救獲得復制能力遠低于野生型PCV2毒株的突變毒株。該突變毒株可以用于研究PCV2復制機制和減毒活疫苗，從而為PCV2的防控提供新思路。

技術領域

本發明涉及豬圓環病毒2型(PCV2)突變毒株的構建，具體涉及GAS樣基序突變的PCV2病毒。

背景技術

PCV2感染造成機體產生免疫抑制，導致PCV2與其他病原體，例如，豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)及豬細小病毒(PPV)等混合感染，還使感染豬對疫苗保護性降低，嚴重威脅著養豬業的發展。雖然PCV2能在PK-15細胞中復制，但是PCV2的復制機制并不明確。研究PCV2?DNA復制機制成為目前研究PCV2復制機制關鍵環節之一。

信號傳導與轉錄激活因子5(STAT5)屬于信號傳導及轉錄激活蛋白家族，是一種能與DNA結合的蛋白質。研究表明，人的STAT5蛋白通過與人細小病毒B19?DNA?GAS樣基序結合促進病毒DNA復制。

但對于PCV2而言，宿主細胞蛋白STAT5是否與病毒的蛋白或DNA結合，并且其結合后對病毒復制帶來怎樣的影響并未得到研究。同時，目前尚難以通過基因工程手段有效獲得復制能力明顯減弱的PCV2突變毒株。

發明內容

本發明的目的在于提供一種GAS樣基序突變的PCV2毒株及其制備方法和應用，該突變毒株的復制能力遠低于野生型PCV2毒株。

為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種突變的PCV2病毒，該突變的PCV2病毒(DNA)在復制中不能與宿主細胞內的STAT5蛋白結合，即所述PCV2病毒的突變位點位于野生型PCV2病毒DNA與STAT5蛋白結合的序列區域內。

優選的，所述野生型PCV2病毒DNA上存在用于與STAT5蛋白結合的GAS樣基序。

優選的，所述PCV2病毒的突變位點位于野生型PCV2病毒(例如，DNA序列如GenBankNo.MH492006.1所示的PCV2?2b亞型毒株)DNA自復制起始點起的第1066nt～1074nt存在的GAS樣基序(TTCTCTGAA)。

優選的，通過將上述GAS樣基序突變為非GAS樣基序(例如，ACGAAAGCC)，使得PCV2DNA(基因組DNA)在病毒復制中不能與宿主細胞蛋白STAT5結合，并導致PCV2病毒的復制能力明顯減弱。

優選的，所述突變的PCV2病毒的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

上述突變的PCV2病毒的制備方法，包括以下步驟：

1)通過序列比對分析PCV2病毒DNA包含的與STAT5蛋白保守的結合位點，然后擴增或人工合成突變的PCV2病毒的DNA序列，所述PCV2病毒的突變位點位于野生型PCV2病毒DNA與STAT5蛋白結合的序列區域內；

2)將上述突變的PCV2病毒的DNA序列環化后轉染宿主細胞(例如，PK-15細胞)，然后進行培養和傳代，得到突變的PCV2病毒。

優選的，所述步驟1)具體包括以下步驟：根據GAS樣基序是STAT5蛋白保守的結合位點，以野生型PCV2病毒DNA為模板，通過重疊PCR擴增得到GAS樣基序突變的PCV2病毒DNA。

優選的，所述野生型PCV2病毒選自PCV2病毒2b亞型(例如，DNA序列如GenBankNo.MH492006.1所示的毒株)。

優選的，所述重疊PCR采用的擴增引物為：

病毒DNA片段I引物：