[發明專利]一種突變體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202011624067.4
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112626044B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 馬富強;陸澤林;江晶潔;張藝凡;楊廣宇
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/10;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 魏毅宏

本發明提供了一種突變體，其氨基酸序列為如下(a)或(b)：(a)至少取代、缺失或添加天然的精氨酸氧化酶的氨基酸序列的一個氨基酸，且與該序列具有90％以上同源性；或(b)至少取代、缺失或添加天然的精氨酸氧化酶的氨基酸序列的一個氨基酸，且與該序列具有相同的功能。本發明提供的精氨酸氧化酶突變體與野生型精氨酸氧化酶相比，突變體熱穩定性更好。通過本發明所提供的構建方法得到的精氨酸氧化酶突變體熱穩定性更好，在較高的溫度下氧化L?精氨酸時，仍然表現出優良的的催化活性，在L?精氨酸生物傳感器檢測及生物化工等領域具有較高的應用潛力。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種突變體及其構建方法和應用。

背景技術

L-氨基酸氧化酶是一類生物體內參與氨基酸氧化代謝的重要氧化還原酶，能夠以氧分子為電子受體催化L-氨基酸氧化脫氨，生成相應的酮酸、氨(NH₃)和過氧化氫(H₂O₂)。有些L-氨基酸氧化酶能夠專一性識別特定氨基酸，而不受其他種類氨基酸的干擾，因而在手性胺類化合物拆分、α-酮酸生物合成、臨床樣本、食品及氨基酸發酵過程中氨基酸含量檢測等領域都發揮著重要作用。其中，L-精氨酸氧化酶能夠特異性識別L-精氨酸，是生命活動的重要催化劑，且催化反應條件溫和、產物單一、耗能小、產物易分離，在食品、化工、環保、能源以及醫藥領域都有著廣泛地應用。然而，由于天然L-精氨酸氧化酶在高溫、極端的酸堿度、有機溶劑、非天然底物、產物抑制等苛刻條件下的穩定性及催化活性將大大降低，限制了其在工業生產方面的應用。

蛋白質工程是以蛋白質分子的結構規律及其生物功能的關系作為基礎，通過化學、物理和分子生物學的手段進行基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造或制造一種新的蛋白質以滿足人類對生產和生活的需求。理性設計是蛋白質工程改造中最常用的方法，利用計算機輔助分子模型結合定點突變，以實現蛋白質功能優化，如提高催化活性、熱穩定性、耐酸堿性等。為了有效優化蛋白質的熱穩定性，Markus Wyss等人于2001 年提出Consensus Concept理論。和常規蛋白質理性設計方法基于蛋白質精確結構-功能關系不同的是，Consensus Concept理論是基于同源蛋白的氨基酸序列信息，從進化的角度分析能提高酶熱穩定性的信息。本發明以 Consensus Concept理論為指導思想，對L-氨基酸氧化酶家族序列進行整合分析，并結合生物信息學輔助，獲得具高穩定性的新型L-精氨酸氧化酶ARod突變體。相關研究目前未見報道。

發明內容

因此，本發明的目的是針對現有的精氨酸氧化酶突變體的熱穩定性不足的問題，提供一種具有熱穩定性的突變體、擴增該精氨酸氧化酶突變體突變位點核酸序列的引物對以及包含該突變體的種可溶性蛋白、酶制劑、重組細胞、重組載體，用于催化氧化L-精氨酸。

根據本公開的第一方面，提供了一種突變體，其氨基酸序列為如下(a) 或(b)：

(a)至少取代、缺失或添加天然的精氨酸氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1的一個氨基酸，且所述突變體的氨基酸序列與SEQ ID NO.1具有90％以上同源性；或

(b)至少取代、缺失或添加天然的精氨酸氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1的一個氨基酸，且所述突變體的氨基酸序列與SEQ ID NO.1具有相同的功能。

在一些可能的實現方式中，突變體的氨基酸序列被配置為SEQ ID NO.1上的突變位點G34D、S38R、Y128R和Q332K中的一個或多個發生突變后的氨基酸序列。

在一些可能的實現方式中，突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO.2～16 中的任一種，其中：

突變體的突變位點為G34D時，該突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

突變體的突變位點為S38R時，該突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO.3。