[發明專利]一種角膜內皮細胞的誘導方法

有效

• 申請號: 202011623910.7
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112608898B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 邊黎穎
• 申請（專利權）人: 江蘇艾爾康生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/071
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明涉及細胞培養技術領域。本發明提供了一種角膜內皮細胞的誘導方法，包括如下步驟(1)將誘導性多能干細胞依次在mTeSR1培養基、雙重Smad抑制劑培養基和第一角膜內皮細胞培養基中培養，得到分化的誘導性多能干細胞；(2)將分化的誘導性多能干細胞消化，用第二角膜內皮細胞培養基吹散細胞得到細胞懸液；(3)將細胞懸液用混合培養基培養，得到角膜內皮細胞。本發明的誘導方法可在較短時間內獲取大量，高純度的角膜內皮細胞，獲得的角膜內皮細胞可在體外傳代至少4次，有效解決人角膜供體數量受限和原代人角膜內皮細胞在體外擴增能力有限的問題。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，尤其涉及一種角膜內皮細胞的誘導方法。

背景技術

角膜由三個細胞層組成，分別是上皮層、基質層和內皮層，角膜內皮是位于角膜內側的4微米厚的單層膜，負責通過使基質脫水來維持角膜透明性。人角膜內皮細胞不能在體內再生，且角膜內皮細胞的密度隨著年齡的增長而逐漸降低，從新生兒的約4000/mm²降低至老年人的約2300/mm²。當角膜內皮細胞密度達到臨界低水平時，基質層會水腫，引起疼痛并產生角膜失明。

完全移植所有角膜層以及僅選擇性替換受損的內皮層，還有新的改進方法，如Descemet膜內皮角膜移植術和Descemet膜內皮轉移是角膜內皮功能障礙的主要手術治療選擇。近年來，原代人角膜內皮細胞的培養雖然取得了新進展；然而，人角膜供體數量十分有限，且原代來源的人角膜內皮細胞在體外擴增能力有限。

發明內容

本發明的目的在于提供一種角膜內皮細胞的誘導方法，解決人角膜供體數量有限和原代來源的人角膜內皮細胞在體外擴增能力有限的問題。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種角膜內皮細胞的誘導方法，包括如下步驟：

(1)將誘導性多能干細胞依次在mTeSR1培養基、雙重Smad抑制劑培養基和第一角膜內皮細胞培養基中培養，得到分化的誘導性多能干細胞；

(2)將分化的誘導性多能干細胞消化，用第二角膜內皮細胞培養基吹散細胞得到細胞懸液；

(3)將細胞懸液用混合培養基培養，得到角膜內皮細胞。

作為優選，所述誘導性多能干細胞在mTeSR1培養基中培養的時間為3～5天。

作為優選，所述誘導性多能干細胞在雙重Smad抑制劑培養基中培養的時間為2～4天，所述雙重Smad抑制劑培養基的制備方法為：按DMEM/F12培養基68.9～84.1份、KSR 15～30份、NEAA 0.9～1.1份的體積比配制基礎培養基，在基礎培養基中加入人重組Noggin、SB431542、谷氨酰胺、β-巰基乙醇和bFGF得到含有300～500ng/mL人重組Noggin、9～11μMSB431542、0.9～1.1mM谷氨酰胺、0.09～0.11mMβ-巰基乙醇、5～20ng/mL bFGF的基礎培養基，即為雙重Smad抑制劑培養基。

作為優選，所述誘導性多能干細胞在第一角膜內皮細胞培養基中培養的時間為1～3天，所述第一角膜內皮細胞培養基的制備方法為：按DMEM/F12培養基68.9～84.1份、KSR15～30份、NEAA 0.9～1.1份的體積比配制基礎培養基，在基礎培養基中加入B27補充劑、PDGF-BB、DKK-2、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇和bFGF得到含有0.09～0.11×B27補充劑、9～11ng/mLPDGF-BB、9～11ng/mL DKK-2、0.8～1.2mM L-谷氨酰胺、0.09～0.11mMβ-巰基乙醇和5～20ng/mLbFGF的基礎培養基，即為第一角膜內皮細胞培養基。

作為優選，所述消化的過程中用Accutase消化，消化溫度為35～39℃，消化時間為3～7min。