[發明專利]一種角膜內皮細胞的誘導方法

有效

• 申請號: 202011623910.7
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112608898B
• 公開（公告）日: 2022-11-11
• 發明（設計）人: 邊黎穎
• 申請（專利權）人: 江蘇艾爾康生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/079
• 分類號: C12N5/079;C12N5/071
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

1.一種角膜內皮細胞的誘導方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將誘導性多能干細胞依次在mTeSR1培養基、雙重Smad抑制劑培養基和第一角膜內皮細胞培養基中培養，得到分化的誘導性多能干細胞；

(2)將分化的誘導性多能干細胞消化，用第二角膜內皮細胞培養基吹散細胞得到細胞懸液；

(3)將細胞懸液用混合培養基培養，得到角膜內皮細胞；

所述誘導性多能干細胞在mTeSR1培養基中培養的時間為3～5天；

所述誘導性多能干細胞在雙重Smad抑制劑培養基中培養的時間為2～4天，所述雙重Smad抑制劑培養基的制備方法為：按DMEM/F12培養基68.9～84.1份、KSR 15～30份、NEAA0.9～1.1份的體積比配制基礎培養基，在基礎培養基中加入人重組Noggin、SB431542、谷氨酰胺、β-巰基乙醇和bFGF得到含有300～500ng/mL人重組Noggin、9～11μM SB431542、0.9～1.1mM谷氨酰胺、0.09～0.11mMβ-巰基乙醇、5～20ng/mLbFGF的基礎培養基，即為雙重Smad抑制劑培養基；

所述誘導性多能干細胞在第一角膜內皮細胞培養基中培養的時間為1～3天，所述第一角膜內皮細胞培養基的制備方法為：按DMEM/F12培養基68.9～84.1份、KSR 15～30份、NEAA0.9～1.1份的體積比配制基礎培養基，在基礎培養基中加入B27補充劑、PDGF-BB、DKK-2、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇和bFGF得到含有0.09～0.11×B27補充劑、9～11ng/mLPDGF-BB、9～11ng/mL DKK-2、0.8～1.2mM L-谷氨酰胺、0.09～0.11mMβ-巰基乙醇和5～20ng/mLbFGF的基礎培養基，即為第一角膜內皮細胞培養基；

所述消化的過程中用Accutase消化，消化溫度為35～39℃，消化時間為3～7min；

所述吹散細胞時先去除消化后的消化液，再加入第二角膜內皮細胞培養基；

所述混合培養基由第二角膜內皮細胞培養基和角膜內皮細胞條件培養基按體積比為1：0.8～1.2的比例配制，所述混合培養基中的培養時間為6～8天；

所述步驟(3)中的細胞懸液和混合培養基的體積比為1：1.8～2.2；

所述第二角膜內皮細胞培養基的制備方法為：按DMEM/F12 45～47份、M199 45～47份、FBS 4.5～5.5份、NEAA 0.8～1.2份、GlutaMAX 0.8～1.2份、ITS 0.8～1.2份的體積比配制基礎培養基，在基礎培養基中加入bFGF、penicillin-streptomycin，得到含有5～20ng/mLbFGF和95～105units/ml penicillin-streptomycin的基礎培養基，即為第二角膜內皮細胞培養基；

所述角膜內皮細胞條件培養基的制備方法為：將角膜后彈力層消化，得到角膜內皮細胞簇，繼續消化得到單個細胞，使用第二角膜內皮培養基培養至融合，傳代培養至P3代，收集P1～P3代的培養上清即為角膜內皮細胞條件培養基。