[發明專利]一種人羊膜間充質干細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 202011623274.8
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112574948A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 張曉南;吳芳春;谷涌泉;侍曉云;張斌
• 申請（專利權）人: 北京昱龍盛世生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 李佳佳

本發明提供一種人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，包括從胎盤上剝離羊膜層、清洗、剪碎和消化，其特征在于：還包括從胎盤上剝離羊膜層后，除去基底膜下的基質組織使分離的羊膜盡可能的薄和除去血細胞，然后再進行剪碎和消化；其中胎盤組織為新鮮的足月順產胎兒的胎盤組織，且胎盤組織經過消毒、清洗后即在無菌條件下，從胎盤上分離羊膜層；且人羊膜不需要先進行上皮細胞的消化分離，而是直接用于消化分離人羊膜間充質干細胞。采用本發明的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法分離得到的人羊膜間充質干細胞純度高、活力強、增值快。結論建立了人羊膜間充質干細胞分離、培養及鑒定方法。hAMSCs具有骨髓間充質干細胞的表型特征。

技術領域

本發明屬于細胞分離培養領域，具體涉及一種人羊膜間充質干細胞的分離培養方法。

背景技術

人羊膜來源干細胞具有多向分化潛能，且因其易于獲得、不引起倫理學爭議、干細胞含量豐富、免疫原性低等特點，有潛力成為未來再生醫學臨床應用的重要種子細胞來源。

近年來的研究證明,人羊膜間充質干細胞(hum-an amniotic mesenchymal stemcells,hAMSCs)具有與骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchy-mal stemcells,BMSCs)相似的表型譜，具有多譜系分化潛能，可分化為三個胚層不同類型的細胞，而且其擴增能力強于BMSCs[1～8],同時具有來源廣泛，不牽涉醫學倫理問題等優勢，因此，hAMSCs作為再生醫學(regenerative medicine)的細胞資源已頗受關注。但是目前關于hAMSCs的分離、培養及鑒定尚無推薦的標準化方案,因此建立其高豐度、高純度、高活力的分離方法、簡便而明確的鑒定指標和適宜的體外傳代培養方案十分必要。

公開號為CN106244521A的中國發明專利是申請公開了一種人羊膜上皮細胞、分離培養方法及用途。所述方法包括如下步驟：(1)將羊膜從胎盤組織上剝離后清洗；(2)將清洗后的羊膜剪碎，并用胰酶消化處理；(3)將消化處理后得到的消化液過篩后，收集細胞濾液，并離心處理；(4)將離心處理得到的細胞用培養基懸浮后接種，并培養；(5)當培養的細胞匯合度達到80～90％后，加入胰酶消化，然后加入培養基終止消化，并傳代培養，即得人羊膜上皮細胞。本發明方法中，通過將羊膜上皮細胞從胎盤上提取分離并純化，然后在體外擴大增殖培養，因而能夠簡易、便捷且規模化的得到羊膜上皮細胞。同時，本發明培養得到的人羊膜上皮細胞純度高，還能夠用于糖尿病等疾病的治療中，并能夠有效控制控制患者的血糖水平。

北京協和醫學院的馮小倩的碩士論文《人羊膜上皮細胞的性質研究》公開了人羊膜間充質干細胞的分離：取標本、對標本進行固定、石蠟包埋切片、人羊膜全層的組織學染色、消化分離人羊膜上皮細胞后消化分離人羊膜間充質干細胞。

以上現有技術存在以下缺陷：得到的人羊膜間充質干細胞里雜質比較多，人羊膜間充質干細胞分離純度低、活力弱、增殖慢。

發明內容

為了解決以上現有技術中的雜質多的技術問題，本發明提供一種人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，具有人羊膜間充質干細胞純度高、活力強、增值快的優點。

為了達到以上目的，采用如下技術方案：一種人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，包括從胎盤上剝離羊膜層、清洗、剪碎和消化，還包括從胎盤上剝離羊膜層后，除去基底膜下的基質組織使分離的羊膜盡可能的薄和除去血細胞，然后再進行剪碎和消化；其中胎盤組織為新鮮的足月順產胎兒的胎盤組織，且胎盤組織經過消毒、清洗后即在無菌條件下，從胎盤上分離羊膜層；且人羊膜不需要先進行上皮細胞的消化分離，而是直接用于消化分離人羊膜間充質干細胞。

優選的是，所述人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，步驟如下：

(1)取胎盤組織，清洗；

(2)從胎盤上分離羊膜層，

(3)除去基底膜下的基質組織，使分離的羊膜盡可能的薄；