[發明專利]一種人羊膜間充質干細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 202011623274.8
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112574948A
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 張曉南;吳芳春;谷涌泉;侍曉云;張斌
• 申請（專利權）人: 北京昱龍盛世生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 李佳佳

1.一種人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，包括從胎盤上剝離羊膜層、清洗、剪碎和消化，其特征在于：還包括從胎盤上剝離羊膜層后，除去基底膜下的基質組織使分離的羊膜盡可能的薄和除去血細胞，然后再進行剪碎和消化；其中胎盤組織為新鮮的足月順產胎兒的胎盤組織，且胎盤組織經過消毒、清洗后即在無菌條件下，從胎盤上分離羊膜層；且人羊膜不需要先進行上皮細胞的消化分離，而是直接用于消化分離人羊膜間充質干細胞。

2.權利要求1所述的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于：所述人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，步驟如下：

(1)取胎盤組織，清洗；

(2)從胎盤上分離羊膜層，

(3)除去基底膜下的基質組織，使分離的羊膜盡可能的?。?/p>

(4)除去血細胞；

(5)將步驟(4)得到的羊膜加工成小碎塊；

(6)對羊膜進行消化；

(7)收集細胞濾液，離心，棄掉上清液，收集沉淀；沉淀重懸，再次離心，棄掉上清液；沉淀加入完全培養基重懸，計數，將細胞接種于培養基中，進行培養；

(8)培養一定時間后換液，然后間隔固定時間換液一次，當細胞融合度打到80％之后按照1:3比例傳代培養，即得分離純化的人羊膜間充質干細胞。

3.權利要求2所述的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于：優選用75％酒精或者加了5％雙抗的PBS消毒并清洗胎盤組織表面。

4.權利要求3所述的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于：步驟(2)在無菌條件下進行；優選羊膜層從胎盤上鈍性分離下來；優選用無菌棉拭子除去基底膜下的基質組織。

5.權利要求4所述的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于：步驟(4)中，除去血細胞的方法為：將羊膜置于培養皿，培養皿中裝有1/2體積的含有1％雙抗的PBS，將羊膜至于培養皿中漂洗并更換培養皿以除去血細胞。

6.權利要求5所述的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于：步驟(5)中，小碎塊的直徑為1-3mm。

7.權利要求6所述的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于：步驟(6)中，消化的具體操作為：將羊膜小碎塊轉移至離心管，將羊膜小碎塊與胰酶消化液與膠原酶II消化液混勻置于恒溫搖床內振蕩；然后終止消化，混勻，過細胞篩，收集過濾液；并將未消化的羊膜繼續加入消化液消化，如此重復直至羊膜組織基本被消化完。

8.權利要求7所述的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于：步驟(6)中，按質量百分比計，胰酶消化液由0.25％胰酶+0.02％EDTA組成；優選膠原酶II消化液質量百分比濃度為0.1％；優選按照體積比，羊膜小碎塊、胰酶消化液、膠原酶II消化液按照1:1:1混合。

9.權利要求8所述的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于：步驟(6)中，恒溫搖床內溫度為37℃，轉速為250r/min，振蕩時間10～20min；優選終止消化通過加入10％FBS的低糖DMEM/F12培養基實現；優選細胞篩為200目。

10.權利要求9所述的人羊膜間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于：步驟(7)中，第一次離心轉速為2000r/min，后續離心轉速為1500r/min；優選第二次重懸時，加入的完全培養基為含10％FBS的低糖DMEM/F12培養基。