[發明專利]一種分枝桿菌的17β-羥基類固醇脫氫酶突變體及其異源表達

有效

• 申請號: 202011620795.8
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112592904B
• 公開（公告）日: 2023-02-07
• 發明（設計）人: 許正宏;李會;劉偉;史勁松;張曉梅;龔勁松
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/75;C12N1/21;C12P33/06;C12R1/125
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 唐蕙芬

本發明公開了一種分枝桿菌的17β?羥基類固醇脫氫酶突變體及其異源表達，屬于酶基因工程及酶工程領域。本發明提供一種來自于分枝桿菌的放線菌17β?羥基類固醇脫氫酶17β?HSDy1及其基因序列，以pMA5為表達質粒，以枯草芽孢桿菌WB600為表達宿主，實現了分枝桿菌LY?1的17β?HSDy1的外源表達。對軟件模擬獲得的該酶關鍵T239位點，突變成了酪氨酸，酶活提高了19.2％，達到9571.77U·mg^?1。對突變獲得的重組枯草芽孢桿菌WB600?pMA5?17βHSDy1?T239Y進行酶活?生長曲線的測定，在發酵28h時，重組枯草芽孢桿菌WB600?pMA5?17βHSDy1?T239Y的比酶活達到最高。該異源表達菌株可用于雄甾烯?1，4?烯?3，17?二酮轉化寶丹酮的生產，具有潛在的工業應用。

技術領域

本發明屬于遺傳工程和發酵工程領域，具體涉及一種來源于分枝桿菌的17β-羥基類固醇脫氫酶突變體及其異源表達。

背景技術

甾體藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，在醫療領域具有廣泛的應用，臨床中常用于治療過敏性疾病、風濕性關節炎、避孕及手術麻醉等。常見的甾體藥物中間體分為C19類與C22類，其中以寶丹酮(BD)、雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(AD)、雄甾烯-1，4-烯-3，17-二酮(ADD)、9α-羥基雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(9α-OH-AD)和睪酮(T)為主的甾體藥物中間體在醫藥領域市場的需求逐年上升。

寶丹酮(BD)是雄激素合成代謝類固醇和睪丸激素(TS)衍生物，可促進蛋白質合成，支持氮保留并刺激腎臟促紅細胞生成素釋放。BD通常是由雄甾烯-4-烯-3，17-二酮(AD)通過化學合成制得的。然而，微生物轉化法具有高立體選擇性、綠色環保等優點，在已逐漸在甾體藥物中間體的應用中發揮著越來越大的作用，近年來通過生物合成BD成了研究的熱點。

17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-HSD)，是一類氧化還原酶，能夠催化甾體中C-17的羥基與酮基之間的相互轉化，反應時需要輔因子NAD(P)H/NAD(P)+。許多微生物可以利用雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)作為底物通過17β-羥基類固醇脫氫酶還原反應以產生BD，但它們的低底物濃度和轉化率不能滿足工業生產要求。迄今為止，研究人員共鑒定出15種類型的17β-HSD同工酶，除17β-HSD5屬于醛、酮還原酶即AKR超家族之外，其他的同工酶都屬于短鏈脫氫酶/還原酶即SDR超家族。

針對此酶在實際轉化甾體藥物中間體中的應用，鑒定更多的、高效的17β-羥基類固醇脫氫酶用于寶丹酮的生物轉化是具有非常重要的意義。

發明內容

發明目的：本發明的目的在于提供一種來源于分枝桿菌的17β-羥基類固醇脫氫酶突變體及其異源表達，通過對酶活性位點的模擬分析，獲得高酶活突變體，并研究了該突變體的相關性質；利用異源表達突變體工程菌成功實現了從雄甾烯-1，4-烯-3，17-二酮(ADD)到寶丹酮的轉化。

本發明通過軟件模擬獲得17β-羥基類固醇脫氫酶的關鍵活性T239位點，將其突變成了酪氨酸，酶活提高了19.2％。將其突變體在枯草芽孢桿菌異源表達，對該突變體的相關性質進行了研究，用于指導后續的工業化應用。利用該突變體異源表達菌株成功實現了從雄甾烯-1，4-烯-3，17-二酮(ADD)到寶丹酮的轉化，為其進一步的工業化應用奠定基礎。

本發明的第一個目的是提供一種17β-羥基類固醇脫氫酶突變體，所述的17β-羥基類固醇脫氫酶突變體是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羥基類固醇脫氫酶的第239位蘇氨酸替換為酪氨酸。

進一步地，將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羥基類固醇脫氫酶的第239位蘇氨酸替換為酪氨酸時，突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述17β-羥基類固醇脫氫酶的基因來源于分枝桿菌Mycobacterium sp LY-1CGMCC No.13031。