[發(fā)明專利]小牛血清動物源性成分種屬的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011620750.0
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN113493825A
• 公開（公告）日: 2021-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜宏明;聶麗;靳美霞;陳珊;劉翠秀
• 申請（專利權(quán)）人: 錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京市隆安律師事務(wù)所 11323
• 代理人: 劉東方

本發(fā)明屬于生化藥物檢測領(lǐng)域，具體提供一種小牛血清動物源性成分種屬的檢測方法，所述動物源性成分為牛源性成分、豬源性成分或羊源性成分，所述方法包括：(1)模板DNA制備：提取樣品的基因組DNA，測定濃度，稀釋，作為樣品模板DNA；(2)PCR擴(kuò)增：取步驟(1)中所得樣品模板DNA，鑒別引物為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；或?yàn)镾EQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；或?yàn)镾EQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；(3)酶切反應(yīng)：取步驟(2)所得樣品模板DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶為Dpn II酶、Mnl I酶、或Sau3A I酶；(4)瓊脂糖凝膠電泳測定：取步驟(3)所得酶切產(chǎn)物，制膠，點(diǎn)樣，電泳。本發(fā)明方法專屬性好、靈敏度高、操作簡便。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化藥物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種小牛血清動物源性成分 種屬的檢測鑒別方法。

背景技術(shù)

小牛血清去蛋白注射液為小牛血清經(jīng)乙醇沉淀去蛋白、濃縮、多次超 濾除菌等工藝制得的無菌水溶液。其已收載于國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中，該標(biāo)準(zhǔn)雖 規(guī)定了產(chǎn)品的動物種屬來源，但并未提出具體的小牛血清種屬來源的檢測 鑒別方法。由于在小牛血清去蛋白注射液生產(chǎn)過程中，小牛血清去蛋白提 取物要經(jīng)多次超濾步驟，本產(chǎn)品的制劑中的活性成分與中間體已不具備通 過核酸分子技術(shù)來檢測鑒別小牛血清的種屬來源的條件，小牛血清由于其 經(jīng)過了攪拌、離心等多道工序而獲得，其模板DNA的含量更低且不易擴(kuò)增， 因此，如何能夠有效檢測出不同種屬來源的小牛血清，對于鑒別產(chǎn)品是否 符合國家有關(guān)的質(zhì)量要求尤為關(guān)鍵。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(Polymerase Chain Reaction，PCR)系指通過提取 樣品中物種的遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸(DNA)，對DNA中具有種屬特異性 的片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，以檢測不同種 屬來源的動物源性成分產(chǎn)品，常規(guī)PCR法采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行檢測，通過與DNA分子量Marker進(jìn)行比較，將樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的 片段大小與預(yù)期大小進(jìn)行比較，從而判斷樣品中是否含有特定的動物源性 成分。

國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21101-2007公開了動物源性飼料中豬源性成分定性檢測 的PCR方法。該方法屬于從固體原料中提取DNA，其模板DNA濃度相對 有保證，擴(kuò)增容易。但是，該方法不適用于藥品行業(yè)中DNA濃度較低的液 體動物源性原料，且該方法使用試劑復(fù)雜，相對于藥品檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室不易操 作。

國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20190-2006公開了飼料中牛羊源性成分定性檢測的 PCR方法。該方法同樣屬于從固體原料中提取DNA，其模板DNA濃度相 對有保證，擴(kuò)增容易。但該方法不適用于藥品行業(yè)中DNA濃度較低的液體 動物源性原料，且該方法使用試劑復(fù)雜，相對于藥品檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室不易操作。

因此，為了有效檢測小牛血清去蛋白注射液的小牛血清的種屬來源以 確定其是否符合相關(guān)質(zhì)量要求，保證小牛血清原料確實(shí)來源于牛源性成分， 亟需一種針對原材料小牛血清的牛、豬及羊源性成分的檢測鑒別方法。

開發(fā)一種專屬性好、靈敏度高、擴(kuò)增速度快、操作簡便、成本低的小 牛血清動物源性成分種屬的檢測方法是有必要的。

發(fā)明內(nèi)容

針對以上技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種專屬性好、靈敏度高、 操作簡便的小牛血清動物源性成分種屬的檢測方法，本發(fā)明所述方法包括 如下步驟：

(1)模板DNA制備：提取樣品的基因組DNA，測定濃度，稀釋，作 為樣品模板DNA；

(2)PCR擴(kuò)增：取步驟(1)中所得樣品模板DNA，鑒別引物為SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2；或?yàn)镾EQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；或?yàn)?SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為樣品模板DNA、鑒 別引物混合液、PCR擴(kuò)增試劑、水，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性1-5分鐘，然后94-95℃變性30-60秒、50-60℃退火30-45秒、72℃延伸30-60秒，循 環(huán)30-35次，72℃延伸5min，4℃保溫結(jié)束反應(yīng)；