[發明專利]小牛血清動物源性成分種屬的檢測方法

在審

• 申請號: 202011620750.0
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN113493825A
• 公開（公告）日: 2021-10-12
• 發明（設計）人: 杜宏明;聶麗;靳美霞;陳珊;劉翠秀
• 申請（專利權）人: 錦州奧鴻藥業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京市隆安律師事務所 11323
• 代理人: 劉東方

1.一種小牛血清動物源性成分種屬的檢測方法，其特征在于，所述動物源性成分為牛源性成分、豬源性成分或羊源性成分，所述方法包括如下步驟：

(1)模板DNA制備：提取樣品的基因組DNA，測定濃度，稀釋，作為樣品模板DNA；

(2)PCR擴增：取步驟(1)中所得樣品模板DNA，鑒別引物為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；或為SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；或為SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；

PCR擴增反應體系為樣品模板DNA、鑒別引物混合液、PCR擴增試劑、無菌水，擴增條件為：94℃預變性1-5分鐘，然后94-95℃變性30-60秒、50-60℃退火30-45秒、72℃延伸30-60秒，循環30-35次，72℃延伸5min，4℃保溫結束反應；

(3)酶切反應：取步驟(2)所得樣品模板DNA擴增產物，限制性內切酶為Dpn II酶、Mnl I酶、或Sau3A I酶；

酶切反應體系為擴增產物、限制性內切酶、酶反應緩沖液、無菌水；

酶切反應條件為：37℃60-120分鐘，65℃5-20分鐘，4℃保溫結束反應；

(4)瓊脂糖凝膠電泳測定：取步驟(3)所得酶切產物，制膠，點樣，電泳。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步驟(2)中擴增條件為：94℃預變性3-5分鐘，然后94-95℃變性30-45秒、55-59℃退火30秒、72℃延伸30-45秒，循環35次，72℃延伸5min，4℃保溫結束反應；

進一步優選擴增條件為：94℃預變性5分鐘，然后94℃變性30秒、57℃退火30秒、72℃延伸30秒，循環35次，72℃延伸5min，4℃保溫結束反應。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步驟(3)中酶切反應條件為：37℃60分鐘，65℃20分鐘，4℃保溫結束反應。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括：所述樣品包括對照品和供試品，所述供試品為小牛血清；所述對照品為小牛血清、豬血清或羊血清。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括：步驟(1)中提取的DNA用水稀釋制成每1ml中含DNA 1.25～5μg的溶液，優選每1ml中含5μg的溶液。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括：步驟(2)中PCR擴增試劑為Premix Ex Taq HS、Taq HS Perfect Mix、或Premix Taq^TM，PCR擴增反應體系為樣品模板DNA 5-8μl、優選5μl；鑒別引物混合液0.5-1μl、優選1μl；擴增試劑10μl、無菌水補足至20μl。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法步驟(2)中PCR擴增試劑為PremixEx Taq HS，PCR擴增反應體系為樣品模板DNA 5μl、鑒別引物混合液1μl、Premix Ex Taq HS10μl、無菌水補足至20μl。

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括：

鑒別牛源性成分時，所述對照品為小牛血清，所述步驟(2)中的鑒別引物為SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述對照品分別在214bp及57bp處各有一條DNA條帶；或

鑒別豬源性成分時，所述對照品為豬血清，所述步驟(2)中的鑒別引物為SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，所述對照品分別在196bp及16bp處各有一條DNA條帶；或

鑒別羊源性成分時，所述對照品為羊血清，所述步驟(2)中的鑒別引物為SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，所述對照品分別在202bp及91bp處各有一條DNA條帶。