[發明專利]一種外泌體包裹AAV載體的制備及純化方法

在審

• 申請號: 202011620726.7
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112662706A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 段莉;梁宇杰;徐曉;徐麗梅
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院(深圳市轉化醫學研究院)
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/87
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 吳彩鳳

本發明屬于基因藥物載體技術領域，公開一種外泌體包裹AAV載體、AAV靶基因載體及其制備方法和應用。將Expi293F細胞用DMEM完全培養基培養，待細胞生長至融合度達細胞培養至3–5×10⁶活細胞/mL用于轉染，轉染前14h用DMEM基礎培養基置換舊的培養基；將pAAV?靶基因質粒，pAAV?RC2質粒和pHelper質粒共轉染至Expi293F細胞培養液中，37℃共轉染12?16h之后，加入無外泌體胎牛血清，繼續培養48?72h，收集上清，離心分離，獲得外泌體包裹AAV靶基因載體。所述外泌體包裹AAV靶基因載體在制備治療靶基因所對應疾病藥物中的應用。本發明制備的外泌體包裹AAV靶基因載體，并進行純化，相較于AAV靶基因載體，外泌體的天然膜結構可有效增強AAV在視網膜組織中的轉運，提高靶基因轉染效率。

技術領域

本發明涉及基因藥物載體領域，具體為一種外泌體包裹AAV載體的制備及純化方法。

背景技術

腺病毒相關病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒(如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒)存在時，才能進行復制和溶細胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。

腺相關病毒載體:現在最常用的腺相關病毒載體是AAVHelper-FreeSystem，即不需要腺病毒輔助載體的包裝系統。

外泌體是指包含了復雜RNA和蛋白質的小膜泡(30-150nm)，現今，其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。1983年，外泌體首次于綿羊網織紅細胞中被發現，1987年Johnstone將其命名為“exosome”。多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體。其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中。

所有培養的細胞類型均可分泌外泌體，且外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。有關他們分泌和攝取及其組成、“運載物”和相應功能的精確分子機制剛剛開始研究。外泌體目前被視為特異性分泌的膜泡，參與細胞間通訊，對外泌體的研究興趣日益增長，無論是研究其功能還是了解如何將其用于微創診斷的開發。

現有技術中沒有外泌體包裹AAV靶基因載體的制備及純化方法，現有技術多次按壓AAV靶基因載體，其不能增強在視網膜組織中的轉運，靶基因轉染效率低。

發明內容

本發明的目的在于提供一種外泌體包裹AAV載體的制備及純化方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種外泌體包裹AAV載體的制備方法，包括以下步驟：

步驟一：將Expi293F細胞用DMEM完全培養基培養，待細胞生長至融合度達3–5×106活細胞/mL時用于轉染，轉染前1-4h用DMEM基礎培養基置換舊的培養基；

步驟二：將pAAV-靶基因質粒、pAAV-RC2質粒和pHelper質粒共轉染至步驟一所得Expi293F細胞培養液中，37℃共轉染12-16h之后，加入無外泌體胎牛血清，繼續培養48-72h，收集上清；

步驟三：外泌體包裹AAV離心分離，獲得外泌體包裹AAV載體。

一種如上所述的外泌體包裹AAV載體的純化方法，包括以下步驟：

步驟一：準備材料，Expi293F細胞、質粒、PEI試劑、Opti-MEM培養基、SMM-293TII培養基，使用前需預熱至37℃；將細胞搖晃混勻后取出100μL細胞置于EP管中，向EP管加入100μL4％臺盼藍溶液，混勻，取10μL進行細胞計數，細胞量需達到2.5-3×106細胞/mL方可進行轉染，細胞活率應在95％以上。若細胞密度高于3×106細胞/mL，用預熱的SMM-293TII培養基進行稀釋，使細胞終濃度為2.5-3×106細胞/mL；