[發明專利]一種外泌體包裹AAV載體的制備及純化方法

在審

• 申請號: 202011620726.7
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112662706A
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 段莉;梁宇杰;徐曉;徐麗梅
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院(深圳市轉化醫學研究院)
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/87
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 吳彩鳳

1.一種外泌體包裹AAV載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：將Expi293F細胞用DMEM完全培養基培養，待細胞生長至融合度達3–5×10⁶活細胞/mL時用于轉染，轉染前1-4h用DMEM基礎培養基置換舊的培養基；

步驟二：將pAAV-靶基因質粒、pAAV-RC2質粒和pHelper質粒共轉染至步驟一所得Expi293F細胞培養液中，37℃共轉染12-16h之后，加入無外泌體胎牛血清，繼續培養48-72h，收集上清；

步驟三：外泌體包裹AAV離心分離，獲得外泌體包裹AAV載體。

2.一種如權利要求1所述的外泌體包裹AAV載體的純化方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：準備材料，Expi293F細胞、質粒、PEI試劑、Opti-MEM培養基、SMM-293TII培養基，使用前需預熱至37℃；將細胞搖晃混勻后取出100μL細胞置于EP管中，向EP管加入100μL4％臺盼藍溶液，混勻，取10μL進行細胞計數，細胞量需達到2.5-3×10⁶細胞/mL方可進行轉染，細胞活率應在95％以上。若細胞密度高于3×10⁶細胞/mL，用預熱的SMM-293TII培養基進行稀釋，使細胞終濃度為2.5-3×10⁶細胞/mL；

步驟二：每50mL細胞需要準備50μg質粒，用3mLOpti-MEM培養基稀釋質粒，混勻后靜置5分鐘；根據具體培養體積等比例增減質粒及Opti-MEM培養基量；

步驟三：每50mL細胞需要準備160μLPEI試劑，用2.8mLOpti-MEM培養基稀釋，混勻后靜置5分鐘；根據具體培養體積等比例增減PEI及Opti-MEM培養基量；

步驟四：將步驟二、三中試劑混勻靜置15分鐘；

步驟五：將試劑加入細胞中，混勻，放置于培養箱內進行培養；

步驟六：48h-72h后收集外泌體。

步驟七：常規培養，Expi293FTM細胞培養至3–5×10⁶活細胞/mL，SMM293TII培養基預熱至37℃，用于培養懸浮細胞的聚碳酸酯或PETG材質、無擋板、一次性無菌通氣搖瓶，例如NalgeneTMPETGErlenmeyer一次性平底無菌錐形瓶，測定活細胞密度和活率所需的試劑和設備，例如，臺盼藍、血球計數板或自動細胞計數儀，軌道搖床置于≥80％相對濕度和8％CO₂的37℃培養箱；

步驟八：設定接種密度和培養體積，利用活細胞密度計算接種到新搖瓶所需的細胞懸液體積；將計算所得體積的細胞移到含有新鮮預熱的Expi293TM表達培養基的培養瓶中；將培養瓶放置于軌道搖床上，并設定培養箱為37℃、相對濕度≥80％和8％CO₂，直至培養物密度達到3-5×10⁶活細胞/mL。

3.根據權利要求2所述的一種外泌體包裹AAV載體的純化方法，其特征在于：所述步驟七中，細胞生長密度控制不超過5×10⁶活細胞/mL。