[發(fā)明專利]一種用于小牛血清動物源性成分種屬檢測的實(shí)時熒光PCR方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011620357.1 | 申請日： | 2020-12-30 |
| 公開（公告）號： | CN113493824A | 公開（公告）日： | 2021-10-12 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 杜宏明;聶麗;靳美霞;陳珊;劉翠秀 | 申請（專利權(quán)）人： | 錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司 |
| 主分類號： | C12Q1/686 | 分類號： | C12Q1/686 |
| 代理公司： | 北京市隆安律師事務(wù)所 11323 | 代理人： | 劉東方 |
| 地址： | 121013 遼*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 用于 小牛 血清 動物 成分 種屬 檢測 實(shí)時 熒光 pcr 方法 | ||
本發(fā)明涉及生化藥物的檢測領(lǐng)域，具體提供一種小牛血清動物源性成分種屬鑒別的實(shí)時熒光PCR方法，所述動物源性成分為牛源性成分、豬源性成分或羊源性成分，所述方法包括：(1)樣品基因組DNA提取；(2)測定步驟(1)所得基因組DNA提取液濃度；(3)PCR反應(yīng)：取步驟(1)所得基因組DNA提取液，用水稀釋制成每1ml中約含基因組DNA 0.62～5μg、優(yōu)選5μg的溶液，作為供試品模板DNA；使用牛源性成分實(shí)時熒光檢測試劑盒、豬源性成分實(shí)時熒光檢測試劑盒或羊源性成分實(shí)時熒光檢測試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測。本發(fā)明方法專屬性好、靈敏度高、操作簡便、檢測通量高。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生化藥物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于小牛血清動物源性 成分種屬檢測的實(shí)時熒光PCR方法。
背景技術(shù)
小牛血清去蛋白注射液是小牛血清經(jīng)乙醇沉淀去蛋白、濃縮、多次超 濾除菌等工藝制得的無菌水溶液，為我國原創(chuàng)獨(dú)家產(chǎn)品，其標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)收載于 國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-398)-2004Z-2013，其起始原材料為小牛血清，是 在潔凈環(huán)境下采集經(jīng)齒齡判斷不滿18個月的小牛現(xiàn)場屠宰后并經(jīng)物理機(jī)械 攪拌過濾去除纖維蛋白后新鮮血液，再經(jīng)離心去除血漿后的血清速凍分裝 制得。小牛血清去蛋白注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)雖規(guī)定了的動物種屬來源，但并未提出具體的種屬檢測鑒別方法。由于鑒別小牛血清的種屬來源，可以有 效提高小牛血清去蛋白注射液的產(chǎn)品質(zhì)量，從而提高產(chǎn)品的一致性評價的 水平，因此，亟需一種針對小牛血清的牛、豬及羊源性成分的檢測鑒別方 法。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(Polymerase Chain Reaction，PCR)系指通過提取 樣品中物種的遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸(DNA)，對DNA中具有種屬特異性 的片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，以確定動物源 性成分的種屬來源，實(shí)時熒光主要采用Taqman探針進(jìn)行產(chǎn)物檢測。
小牛血清去蛋白注射液制劑生產(chǎn)過程中由于其活性成分已經(jīng)多次超濾 等步驟，已經(jīng)不具備通過核酸分子技術(shù)鑒別種屬來源的條件，而且小牛血 清中的可捕獲的遺傳物質(zhì)的生物信息更少，要開發(fā)小牛血清種屬鑒別的核 酸檢測方法更加困難。
CN108676896A公開了一種小牛血去蛋白提取物動物源性成分的檢測 的試劑盒及方法，該方法只是提出用于小牛血去蛋白提取物及小牛血去蛋 白提取物注射液的粗提物，而非針對小牛血清，該方法實(shí)際操作過程繁瑣 復(fù)雜，對產(chǎn)品的原材料的質(zhì)量控制水平較低。
國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21103-2007公開了動物源性飼料中哺乳動物源性成分 定性檢測的實(shí)時熒光PCR方法。但該方法操作繁瑣，在藥品檢驗(yàn)驗(yàn)室不易 操作。
針對以上技術(shù)現(xiàn)狀，開發(fā)一種專屬性好、靈敏度高、操作簡便、檢測 通量高的小牛血清動物源性成分種屬鑒別的方法是有必要的。
發(fā)明內(nèi)容
針對以上技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種專屬性好、靈敏度高、 操作簡便、檢測通量高的小牛血清動物源性成分種屬鑒別的實(shí)時熒光PCR 方法，其中所述動物源性成分為牛源性成分、豬源性成分或羊源性成分。
本發(fā)明所述小牛血清動物源性成分種屬鑒別的實(shí)時熒光PCR方法，包 括如下步驟：
(1)樣品基因組DNA提取；
(2)測定步驟(1)所得基因組DNA提取液濃度；
(3)PCR反應(yīng)：取步驟(1)所得基因組DNA提取液，用水稀釋制成 每1ml中約含基因組DNA 0.62～5μg、優(yōu)選5μg的溶液，作為供試品模板 DNA；使用牛源性成分實(shí)時熒光檢測試劑盒、豬源性成分實(shí)時熒光檢測試 劑盒、或羊源性成分實(shí)時熒光檢測試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光PCR檢測；
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