[發明專利]一種用于小牛血清動物源性成分種屬檢測的實時熒光PCR方法

在審

• 申請號: 202011620357.1
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN113493824A
• 公開（公告）日: 2021-10-12
• 發明（設計）人: 杜宏明;聶麗;靳美霞;陳珊;劉翠秀
• 申請（專利權）人: 錦州奧鴻藥業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 北京市隆安律師事務所 11323
• 代理人: 劉東方

1.一種小牛血清動物源性成分種屬鑒別的實時熒光PCR方法，其特征在于，所述動物源性成分為牛源性成分、豬源性成分或羊源性成分，所述方法包括如下步驟：

(1)樣品基因組DNA提取；

(2)測定步驟(1)所得基因組DNA提取液濃度；

(3)PCR反應：取步驟(1)所得基因組DNA提取液，用水稀釋制成每1ml中約含基因組DNA0.62～5μg、優選5μg的溶液，作為供試品模板DNA；使用牛源性成分實時熒光檢測試劑盒、豬源性成分實時熒光檢測試劑盒或羊源性成分實時熒光檢測試劑盒進行實時熒光PCR檢測；

其中從牛、豬或羊源性成分實時熒光PCR檢測試劑盒中取出相應的實時熒光PCR反應用試劑，融化后，2000r/min離心5s，向每個實時熒光PCR反應管中分裝2X預混液、引物混合液、探針混合液、模板DNA、無菌純化水共25ul，蓋緊蓋，離心5～10秒。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步驟(1)進一步包括：使用Magnetic DNA Purification System for Food試劑盒進行提取。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步驟(3)中牛源性成分實時熒光檢測試劑盒為Takara Realtime PCR Bovine DNA Detection Kit。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步驟(3)中豬源性成分實時熒光檢測試劑盒為Takara Realtime PCR Porcine DNA Detection Kit。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法步驟(3)中羊源性成分實時熒光檢測試劑盒為Takara Realtime PCR Ovine DNA Detection Kit。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括：步驟(2)采用紫外-可見分光光度法或DNA濃度測定儀器進行基因組DNA提取液的濃度測定。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)進一步包括：在實時熒光PCR反應管中，按下表配制實時熒光PCR體系：

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)進一步包括：

陽性對照：取1μl試劑盒提供陽性質控品溶液，加4μl純水，混勻，替代供試品，其中牛源性成分檢測的陽性對照為Control DNA for Bovine，豬源性成分檢測的陽性對照為Control DNA for Porcine，或羊源性成分檢測的陽性對照為Control DNA for Ovine；

陰性對照：用5μl純水替代供試品。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)進一步包括：將實時熒光PCR反應管放入實時熒光PCR儀內，記錄樣本擺放順序，采用的循環條件為：95℃/10s，1個循環；95℃/5s，60℃/20～34s、優選60℃/30s，40個循環，每次循環的退火時收集FAM及HEX通道的熒光。

10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進一步包括：

結果判斷：根據軟件自動設定的閾值，直接讀取各樣品的Ct值；

陽性對照：有FAM和HEX熒光信號檢出，并出現典型的擴增曲線，Ct值應小于28.0；

陰性對照：有HEX熒光信號檢出，并出現典型的擴增曲線，Ct值應小于28.0，而無FAM熒光信號檢出；

按下表對樣品檢測結果進行判斷：