[發(fā)明專(zhuān)利]含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011618164.2
• 申請(qǐng)日: 2020-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112921001A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張建民;王靚
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 國(guó)典（北京）醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/10;C12N15/54;A61K35/12;A61P25/00;A61P25/28;A61P39/06
• 代理公司: 北京尚誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

本發(fā)明公開(kāi)一種含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)將體外合成的NAMPT mRNA轉(zhuǎn)染入iPS細(xì)胞中的方法獲得一種含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體，該外泌體中NAMPT蛋白含量是普通iPS細(xì)胞分泌的外泌體中NAMPT蛋白含量的2倍以上，且該含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體相對(duì)于普通iPS細(xì)胞分泌的外泌體能夠顯著改善衰老細(xì)胞情況，并對(duì)神經(jīng)元有顯著的保護(hù)作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)在體內(nèi)有兩種存在形式，細(xì)胞內(nèi)NAMPT和細(xì)胞外NAMPT(eNAMPT)。其中細(xì)胞內(nèi)NAMPT催化煙酰胺與5-磷酸核糖基-1焦磷酸鹽縮合生成煙酰胺單核苷酸，是合成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)補(bǔ)救途徑的一種限速酶，而細(xì)胞外NAMPT在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)表達(dá)后，隨著外泌體(是包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)的小膜泡(30-150nm)，被視為特異性分泌的膜泡，參與細(xì)胞間通訊)排至細(xì)胞外，同時(shí)具有多種細(xì)胞因子的功能。研究表明，NAMPT控制了NAD的生物合成及下游分子NAD依賴(lài)的組蛋白去乙酰化酶沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirtuin-1,SIRT1)的活性，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、腫瘤、衰老和代謝中均有重要作用。

近期研究發(fā)現(xiàn)(Yoshida,M.等(2019).Extracellular Vesicle-ContainedeNAMPT Delays Aging and Extends Lifespan in Mice.Cell Metab 30,329-342e325.)，以外泌體方式對(duì)老年小鼠補(bǔ)充一種來(lái)自于青年小鼠的酶eNAMPT，可以使老年小鼠通過(guò)增強(qiáng)eNAMPT的方式提升β-煙酰胺單核苷酸的合成能力，表現(xiàn)出體力活動(dòng)、睡眠質(zhì)量、認(rèn)知功能、葡萄糖代謝和神經(jīng)功能的顯著改善。并有研究表明外泌體可以透過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦，使利用外泌體作為載體遞送藥物進(jìn)入大腦成為可能。然而，現(xiàn)有含有NAMPT蛋白的外泌體的獲得方式為細(xì)胞自分泌，獲取量有限；并且人體內(nèi)外泌體中NAMPT蛋白的含量會(huì)隨年齡增大而減少。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題的一個(gè)或多個(gè)，本發(fā)明一個(gè)方面提供一種含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體，其由高表達(dá)NAMPT蛋白的iPS細(xì)胞分泌所得，且所述外泌體中的NAMPT蛋白含量為普通的iPS細(xì)胞分泌的外泌體中NAMPT蛋白含量的2倍以上；所述高表達(dá)NAMPT蛋白的iPS細(xì)胞通過(guò)將體外合成的NAMPT mRNA轉(zhuǎn)染入iPS細(xì)胞獲得。

上述的含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體還包含DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等物質(zhì)。

上述含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體的粒徑為30～150nm，表面標(biāo)志物中CD9占比≥60％，CD63占比≥25％。

本發(fā)明另一方面還提供上述的含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體的制備方法，包括以下步驟：

T1：以NAMPT基因的編碼序列為模板體外合成NAMPT mRNA；

T2:將T1合成的NAMPT mRNA轉(zhuǎn)染入iPS細(xì)胞中，獲得高表達(dá)NAMPT蛋白的iPS細(xì)胞；

T3：培養(yǎng)步驟T2獲得的高表達(dá)NAMPT蛋白的iPS細(xì)胞，獲得含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體。

上述方法中，步驟T1中，所述NAMPT基因的編碼序列為使用PCR引物擴(kuò)增獲得，其中所述PCR引物的正向引物為序列表中SEQ ID NO:2所示；反向引物為序列表中SEQ ID NO:3所示。

上述方法中，步驟T3的具體操作為：每天換入新鮮的iPS細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)高表達(dá)NAMPT蛋白的iPS細(xì)胞，收集換出的培養(yǎng)液，從換出的培養(yǎng)液中分離純化獲得含高表達(dá)NAMPT蛋白的外泌體。