[發明專利]一種基于熒光RMA法多重檢測呼吸道合胞病毒亞型的引物探針組、試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202011617830.0
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112831601A
• 公開（公告）日: 2021-05-25
• 發明（設計）人: 劉祥舉;包建民;陳大為;陳龍;張瑤
• 申請（專利權）人: 濟南國益生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 濟南信在專利代理事務所(特殊普通合伙) 37271
• 代理人: 黃波

本申請屬于呼吸道合胞病毒檢測技術領域，一種基于熒光RMA法多重檢測呼吸道合胞病毒亞型的引物探針組、試劑盒及其檢測方法，所述試劑盒包括擴增反應試劑、緩沖液、醋酸鎂、標準陽性質粒、無菌雙蒸水；所述擴增反應試劑包括RSV?A和RSV?B的引物和探針、M?MLV逆轉錄酶、大腸桿菌RecA蛋白、UvsY蛋白、單鏈結合蛋白GP32、Bst聚合酶、核酸外切酶III、聚環氧乙烷、海藻糖、甘露醇、ATP、dNTPs、肌酸激酶和磷酸肌酸。

技術領域

本申請屬于呼吸道合胞病毒檢測技術領域，具體為一種基于熒光RMA法多重檢測呼吸道合胞病毒亞型的引物探針組、試劑盒及其檢測方法。

背景技術

呼吸道合胞病毒(RSV)是一種RNA病毒，屬副粘液病毒科，是嬰幼兒呼吸道感染最常見的病原體，可引起間質性肺炎及毛細支氣管炎。RSV根據其抗原性的差異分為RSV-A和RSV-B兩個主要的抗原亞型，兩種亞型獨立傳播。對于兩種亞型RSV感染患者的臨床特征的研究一直是RSV感染研究的重要的方向，對其的研究將為RSV感染的治療及疫苗的開發提供路徑，具有極為重要的意義。

目前檢測呼吸道合胞病毒的方法較多，但都存在不足，如病毒分離培養法耗時極長且假陰性較多，不能作為呼吸道合胞病毒快速診斷的方法；直接免疫熒光檢測法檢測靈敏度、特異性較低，樣本易污染且干擾物質較多，濃度過高或者過低時都容易造成結果錯判，需要重復檢測、復查才能確診，檢測的可信度較差；酶聯免疫法檢測的是病毒特異性抗體但一次僅能檢測一種病毒；熒光定量PCR法操作程序復雜、需要精密的儀器、檢測時間較長，不利于非實驗室環境下現場檢測以及基層實驗室的推廣應用。

重組酶介導擴增(RMA)技術是一種核酸等溫擴增技術，主要依賴重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶三種酶。其原理是重組酶與引物結合形成復合體，并在雙鏈DNA中識別同源序列；然后重組酶解開雙鏈，引物與同源序列發生鏈交換反應并啟動DNA合成，對模板進行指數式擴增；被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。RMA反應最適溫度在37～42℃，整個過程在10-30min內即可完成，30min內就可以將靶序列擴增到10～12數量級，可實現核酸的快速檢測。

發明內容

為了解決現有技術的問題，本申請提供了一種基于熒光RMA法多重檢測呼吸道合胞病毒亞型的引物探針組、試劑盒及其檢測方法，本申請是通過下述方案實現的：

一種基于熒光RMA法多重檢測呼吸道合胞病毒亞型的引物探針組，包括根據RSV-A和RSV-B的G基因序列設計的引物和探針，其中，RSV-A的引物和探針序列為：

RSV-A-F：

5’-ATATGCAGCAACAATCCAACCTGCTGGGCTATCTG-3’；

RSV-A-R：

5’-CTCGGATGTTGTGGAGACTTGAGAAGGGCTTAGAT-3’；

RSV-A-P：

5’-ATCCAAAACTCACAAGTCAAATGGAAACC(FAM-dT)(THF)CCAC(BHQ-dT)CAACCTCCTCCGAA(C3-spacer)-3’；

RSV-B引物和探針序列為：

RSV-B-F：

5’-AAGACACGCAATCCAACAGCAATCCCTCTACTCAA-3’；

RSV-B-R：

5’-TCTATGGATCAGCAACTCCATGGTTATTTGCCCCA-3’；

RSV-B-P：