[發明專利]一種從非神經細胞轉化制備保留年齡特征的人源性背根節神經元的方法

在審

• 申請號: 202011617656.X
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN114262687A
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 劉猛六;柳明杰;沈雁飛
• 申請（專利權）人: 寧波易賽騰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0793;C12Q1/02
• 代理公司: 北京樂知新創知識產權代理事務所(普通合伙) 11734
• 代理人: 江宇

本發明涉及一種從非神經細胞轉化制備保留年齡特征的背根節神經元的方法。本發明的制備方法優化了關鍵的細胞直接轉分化基因組合及調控表達水平的啟動子，包裝可以高效感染各種年齡供體源細胞的病毒，并采用合適的包被基質促進供體源細胞及轉化后的神經細胞貼壁生長，并利用含有可以促進轉分化的小分子化合物與生長因子的誘導分化培養液，在10?14天內經過若干次更換分化培養液后轉分化得到大量的背根節神經元，最后經過分離純化獲得高純度的背根節神經元。

技術領域

本發明涉及神經痛的研究和治療領域，更具體地，本發明涉及與之相關的一種從非神經細胞轉化制備保留年齡特征的人源性背根節神經元的方法。

背景技術

神經痛是一種臨床常見的復雜疾病，根據病因或發病部位分為很多類型，如帶狀皰癥后遺神經痛、癌性神經痛、糖尿病性神經痛、中風后神經痛、三叉神經痛、舌咽神經痛等。各種長期慢性的神經痛都會嚴重影響患者的生活質量，有的劇痛甚至會導致病人難以忍受而自殺。多種神經痛均呈現年齡相關性(誘發疾病也與年齡密切相關)，如帶狀皰疹后遺神經痛的發生主要在成年以后，年齡越大發病率越高。糖尿病性神經痛、中風后神經痛等也均呈現明顯的年齡相關性。

背根節神經元是分布于脊髓背根節的外周感覺神經元，是各種痛覺傳入中樞的初級神經元，與多種疼痛癥狀及其發病機制密切相關。采用發病階段人源背根節神經元作為細胞病理模型對深入研究神經痛的發病機制、篩選研發有效的治療藥物以及開發基因療法等具有非常重要的意義以及極為可觀的市場價值。

背根節神經的獲得方式主要包括原代培養和分化兩種方式。原代培養動物(以小鼠、大鼠為主)背根節神經細胞技術相對成熟且來源充足。然而，人與其它動物的神經系統具有較大的差異，動物來源的神經細胞種屬不匹配，病理機制(與人類)不相符是導致眾多研究成果不可靠及篩選藥物無效的主要原因；原代培養人源的神經細胞，雖解決了種屬匹配問題，但由于技術、倫理與法律的限制，僅有少數機構能夠獲得極其有限數量的人源的神經細胞，無法保障廣泛的研究和藥物篩選的使用。很顯然，原代培養動物及人源背根神經細胞都無法保障或滿足機制研究及篩藥的需要。如何能源源不斷地獲得具有年齡及病理特征的人源性背根節神經細胞一直是一項尚待攻克的國際性難題。

由2012年諾貝爾醫學或生理學獎得主山中伸彌等人提出的誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)技術雖然解決了無法獲得人源性亞神經細胞的難題，但iPSC誘導技術方法較為復雜，分離及鑒定過程繁瑣，獲得細胞的時間較長(6-7個月)，而且在制備過程中細胞被重設至胚齡特征，從而失去了神經痛病理模型細胞所需要的發病階段的關鍵病理特征。雖然iPSC誘導亞型神經細胞在神經退行疾病的治療領域應用前景較大，但由于現代技術的限制以及神經細胞的修復特征，在短時期內將其用于修復神經退行性疾病損傷還有諸多無法解決的問題。而在機制研究及新藥篩選領域，iPSC誘導的神經細胞由于失去了發病年齡以及關鍵的病理特征，其實際應用效果也有待深入評估驗證?；趇PSC技術制備背根節神經元的相關方法可參見Nickolls等公開發表的論文(Transcriptional programming of human mechanosensory neuron subtypes frompluripotent stem cells，Cell Reports，2020)。

直接轉分化技術(直接細胞重編程技術)是在iPSC技術基礎上快速發展崛起的一種新興生物技術，即，在特定的培養條件下，利用特定的基因組合等促使不同細胞類型之間互相直接轉換。目前利用這一技術已可從多種體細胞直接轉分化得到若干特化亞型神經元，包括背根節神經元、運動神經元以及抑制性中間神經元等。該技術的獨特優勢在于所生成的患者功能性神經細胞保留了母細胞的年齡相關特征以及患者體內同類神經細胞受到疾病影響的關鍵病理特征，因此在發病階段疾病的病理機制研究、新藥篩選、藥物研發及基因療法開發方面具有引人矚目的應用前景。相應地，由此生成的正常人功能性神經細胞則保留了母細胞的年齡特征及正常的生理功能特征，可以用于藥物的毒性分析測試等。