[發明專利]一種從非神經細胞轉化制備保留年齡特征的人源性背根節神經元的方法

在審

• 申請號: 202011617656.X
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN114262687A
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 劉猛六;柳明杰;沈雁飛
• 申請（專利權）人: 寧波易賽騰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0793;C12Q1/02
• 代理公司: 北京樂知新創知識產權代理事務所(普通合伙) 11734
• 代理人: 江宇

1.一種從非神經細胞轉化制備保留年齡特征的背根節神經元的方法，其包括如下步驟：

1)構建含有細胞轉分化基因組合的病毒載體，并通過轉染細胞進行病毒包裝；

2)培養供體源細胞，并用經包裝的病毒感染經培養的供體源細胞；

3)在誘導分化培養液中誘導所述供體源細胞直接轉分化為背根節神經元；以及

4)分離純化所得的背根節神經元，

其中，所述細胞轉分化基因組合包含以下基因的組合：(1)選自NGN1、NGN2和ASCL1中的至少一種基因；(2)選自ISL1、ISL2、Brn3a、Brn3b和Brn3c中的至少兩種基因；以及任選的(3)選自SOX4和SOX11中的至少一種基因。

2.權利要求1所述的方法，其中所述基因為來源于人、小鼠或其它任何種屬的同源基因。

3.權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述病毒載體選自逆轉錄病毒載體、慢病毒載體或AAV病毒載體；和/或載體中調控表達水平的啟動子選自CMV、CAG、EF1α、PGK、TRETight、TRE3G中的任何一種或多種，優選地，所述啟動子選自CMV。

4.權利要求1-3中任一項所述的方法，其中在病毒載體的構建過程中可通過不同來源的2A序列或IRES序列來連接上述基因，并可任選地進一步引入熒光報告基因。

5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述供體源細胞為任何年齡的正常人或患者的皮膚成纖維細胞或其它非神經元細胞，例如干細胞、肺成纖維細胞、包皮成纖維細胞、膠質細胞，優選地，所述供體源細胞為正常人或患者的皮膚成纖維細胞。

6.權利要求1-5中任一項所述的方法，其中在培養供體源細胞的過程中采用合適的包被基質對培養容器進行預包被，所述合適的包被基質選自層粘連蛋白、明膠、纖連蛋白、Matrigel中的至少一種，優選地，所述包被基質為Matrigel。

7.權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述誘導分化培養液含有促進轉分化的小分子化合物以及生長因子的組合，所述促進轉分化的小分子化合物包含佛司可林(FSK)、cAMP、雙丁酰環腺苷酸(DB-cAMP)、RA、LDN-193189(LDN)、SB431542、CHIR99021中的一種以上，優選地，所述小分子化合物為佛司可林和/或LDN-193189；所述生長因子包含bFGF2、NGF、GDNF、NT3中的一種以上，優選地，所述生長因子為bFGF2。

8.權利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述分離純化是將轉分化后的細胞消化并重懸為單細胞懸浮液，用細胞濾器、流式細胞儀或在明膠包被的培養皿上差異性貼壁等方法以分離得到高純度的背根節神經元。

9.采用權利要求1-8中任一項所述的方法制備得到的保留年齡特征的背根節神經元。

10.權利要求9所述的保留年齡特征的背根節神經元在建立用于篩選疼痛治療藥物的方法中的用途。