[發(fā)明專利]外泌體表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體用于中和新冠病毒的生產(chǎn)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011616251.4
• 申請(qǐng)日: 2020-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN112626030A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 段莉;梁宇杰;徐曉;徐麗梅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市第二人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/13;C12N15/85;C07K16/10
• 代理公司: 北京挺立專利事務(wù)所(普通合伙) 11265
• 代理人: 吳彩鳳

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，外泌體表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體用于中和新冠病毒的生產(chǎn)方法，該外泌體的表面展示有Spike納米抗體，本發(fā)明還公開了表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體的外泌體的制備方法，包括以下制作步驟：步驟一：Expi293F^TM細(xì)胞利用SMM 293TII培養(yǎng)基培養(yǎng)至4×106活細(xì)胞/mL；步驟二：準(zhǔn)備1000ml細(xì)胞量，需要準(zhǔn)備pdisplay?spike?nanobody 500μg質(zhì)粒，用10mL Opti?MEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，混勻后靜置5分鐘；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明技術(shù)方案通過(guò)外泌體的結(jié)構(gòu)形式實(shí)現(xiàn)藥用，相比單克隆抗體具有價(jià)格低廉，制作容易并且具有很好的組織滲透性，利于市場(chǎng)推廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為外泌體表面展示棘突蛋白 Spike的納米抗體用于中和新冠病毒的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

已知SARS-CoV-2病毒的感染過(guò)程是通過(guò)其突刺蛋白(Spike)與宿主細(xì)胞受體ACE2之間的相互作用而進(jìn)入宿主細(xì)胞。因此阻Spike 與ACE2的結(jié)合可以抑制病毒的感染。本專利方法開發(fā)出一種外泌體可破壞突刺蛋白與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)之間相互作用的外泌體納米抗體。我們的研究結(jié)果證明外泌體上展示Spike納米抗體與突刺蛋白緊密結(jié)合，從而阻斷新冠病毒與ACE2之間的結(jié)合，最終能抑制其感染靶細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供外泌體表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體用于中和新冠病毒的生產(chǎn)方法，以解決背景技術(shù)中提到的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：表面展示棘突蛋白 Spike的納米抗體的外泌體，該外泌體的表面展示有Spike納米抗體。

優(yōu)選的，Spike納米抗體通過(guò)噴霧方式直接通過(guò)氣溶膠介導(dǎo)遞送至氣道上皮。

優(yōu)選的，Spike納米抗體在霧化、凍干和常溫條件下仍保持活性。

優(yōu)選的，Spike納米抗體與新冠病毒上突刺蛋白緊密結(jié)合。

表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體的外泌體的制備方法，包括以下制作步驟：

步驟一：Expi293F^TM細(xì)胞利用SMM 293TII培養(yǎng)基培養(yǎng)至4×106 活細(xì)胞/mL；

步驟二：準(zhǔn)備1000ml細(xì)胞量，需要準(zhǔn)備pdisplay-spike-nanobody 500μg質(zhì)粒，用10mL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，混勻后靜置5分鐘；

步驟三：準(zhǔn)備1000μL PEI試劑，用10mL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，混勻后靜置5分鐘；

步驟四：將步驟二、步驟三中稀釋后的質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑混勻靜置 30分鐘；

步驟五：將試劑加入細(xì)胞中，混勻，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；

步驟六：轉(zhuǎn)染8小時(shí)后，離心(800rpm,10min),去掉上清，細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到新的搖瓶中，重新加入1000ml SMM 293TII培養(yǎng)基；

步驟七：培養(yǎng)72h后，離心(800rpm,10min)，收集第一次的上清；

步驟八：離心后的細(xì)胞沉淀繼續(xù)加培養(yǎng)基1000ml,再培養(yǎng)72h后，離心(800rpm,10min)，收集第二次的上清；

步驟九：二次上清合并一起進(jìn)行差速離心富集法，具體為：

1)、離心去細(xì)胞及碎片：將上清至離心管中，于4℃以3000g離心10min，去除細(xì)胞碎片；離心后上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；

2)、離心去雜質(zhì)：轉(zhuǎn)移后的上清液于4℃以10000g離心30min，去除樣品中雜質(zhì)，將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；