[發(fā)明專利]外泌體表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體用于中和新冠病毒的生產(chǎn)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011616251.4
• 申請日: 2020-12-31
• 公開（公告）號: CN112626030A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 段莉;梁宇杰;徐曉;徐麗梅
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/13;C12N15/85;C07K16/10
• 代理公司: 北京挺立專利事務所(普通合伙) 11265
• 代理人: 吳彩鳳

1.外泌體表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體，其特征在于：該外泌體的表面展示有Spike納米抗體。

2.根據(jù)權利要求1所述的外泌體表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體，其特征在于：Spike納米抗體通過噴霧方式直接通過氣溶膠介導遞送至氣道上皮。

3.根據(jù)權利要求1所述的外泌體表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體，其特征在于：Spike納米抗體在霧化、凍干和常溫條件下仍保持活性。

4.根據(jù)權利要求1所述的外泌體表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體，其特征在于：Spike納米抗體與新冠病毒上突刺蛋白緊密結合。

5.如根據(jù)權利要求1-4任意一項所述的外泌體表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體的制備方法，其特征在于，包括以下制作步驟：

步驟一：Expi293F^TM細胞利用SMM 293TII培養(yǎng)基培養(yǎng)至4×106活細胞/mL；

步驟二：準備1000ml細胞量，需要準備pdisplay-spike-nanobody 500μg質粒，用10mLOpti-MEM培養(yǎng)基稀釋質粒，混勻后靜置5分鐘；

步驟三：準備1000μL PEI試劑，用10mL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，混勻后靜置5分鐘；

步驟四：將步驟二、步驟三中稀釋后的質粒及轉染試劑混勻靜置30分鐘；

步驟五：將試劑加入細胞中，混勻，放置于培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)；

步驟六：轉染8小時后，離心(800rpm,10min),去掉上清，細胞沉淀轉移到新的搖瓶中，重新加入1000ml SMM 293TII培養(yǎng)基；

步驟七：培養(yǎng)72h后，離心(800rpm,10min)，收集第一次的上清；

步驟八：離心后的細胞沉淀繼續(xù)加培養(yǎng)基1000ml,再培養(yǎng)72h后，離心(800rpm,10min)，收集第二次的上清；

步驟九：二次上清合并一起進行差速離心富集法，具體為：

1)、離心去細胞及碎片：將上清至離心管中，于4℃以3000g離心10min，去除細胞碎片；離心后上清液轉移到新的離心管中；

2)、離心去雜質：轉移后的上清液于4℃以10000g離心30min，去除樣品中雜質，將離心后的上清液轉移至新的離心管中；

3)、離心收集外泌體：轉移后的上清液于4℃以200000g離心60min，將離心后的沉淀用PBS溶解制作出外泌體納米抗體。

6.根據(jù)權利要求5所述的外泌體表面展示棘突蛋白Spike的納米抗體的制備方法，其特征在于：步驟一中的培養(yǎng)條件是用培養(yǎng)懸浮細胞的一次性無菌通氣搖瓶，軌道搖床置于≥80％相對濕度和8％CO2的37℃培養(yǎng)箱。