[發明專利]功能序列和結構模擬相結合的基因挖掘方法、NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體及應用

在審

• 申請號: 202011613020.8
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112908417A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 薛亞平;程峰;張嘉敏;鄒樹平;徐建妙;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G16B20/50
• 分類號: G16B20/50;G16B35/00;G16B50/30
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發明公開了一種功能序列和結構模擬相結合的基因挖掘方法、NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體及應用。所述基因挖掘方法包括：(1)分析NADH型谷氨酸脫氫酶應具備的特性序列；(2)根據特征序列搜索基因庫；(3)對搜索獲得的基因進行聚類分析和蛋白結構模擬；(4)選擇基因聚合度高且蛋白結構與已知草銨膦脫氫酶結構類似的基因作為候選基因。經基因挖掘得到來源于堆肥賴氨酸桿菌(Lysinibacillus composti)氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的野生型草銨膦脫氫酶，并經過突變篩選到NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體，突變位點選自以下一種：(1)A144G?V375F?M91A；(2)A144G?V345A?M91A；(3)A144G，該突變體酶能夠利用廉價的輔酶NAD進行催化反應。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種功能序列和結構模擬相結合的基因挖掘方法、NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體及應用。

背景技術

草銨膦(phosphinothricin，也叫glufosinate，簡稱PPT)的化學名稱為2-氨基-4-[羥基(甲基)膦酰基]-丁酸，是世界第二大轉基因作物耐受除草劑，由赫斯特公司(幾經合并后現歸屬拜耳公司)開發生產，又稱草銨膦銨鹽、Basta、Buster等，屬膦酸類除草劑，非選擇性(滅生性)觸殺型除草劑是谷氨酰胺合成酶抑制劑。

草銨膦有兩種光學異構體，為L-草銨膦和D-草銨膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，對人類和動物的毒性較小，除草譜廣，對環境的破壞力小。

目前，市場上銷售的草銨膦一般都是外消旋混合物。若草銨膦產品能以L-構型的純光學異構體形式使用，可顯著降低草銨膦的使用量，這對于提高原子經濟性、降低使用成本、減輕環境壓力具有重要意義。

手性純L-草銨膦的制備方法主要有三種：手性拆分法，化學合成法和生物催化法。生物催化法生產草銨膦則具有立體選擇性嚴格、反應條件溫和、收率高等優點，是生產L-草銨膦的優勢方法。主要包括以下三類：

1)以L-草銨膦的衍生物為底物，通過酶法直接水解獲得，主要的優點轉化率高，產物e.e.值較高，但需要昂貴且不易獲得的手性原料作為前體，成本加高，不利于工業化生產。例如生物法制備L-草銨膦最簡單的方法就是利用蛋白酶直接水解雙丙氨膦。雙丙氨膦是一種天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，雙丙氨膦脫去2分子L-丙氨酸，生成L-草銨膦。

2)以外消旋草銨膦的前體為底物，通過酶的選擇性拆分獲得。主要優點為原料相對易得，催化劑活力高，但其理論收率只能達到50％，會造成原料的浪費。例如Cao等人(CaoC-H，Cheng F，Xue Y-P，Zheng Y-G(2020)Efficient synthesis of L-phosphinothricinusing a novel aminoacylase mined from Stenotrophomonas maltophilia.Enzyme andMicrobial Technology 135doi：10.1016/j.enzmictec.2019.109493)采用一種來源于Stenotrophomonas maltophilia的新型的氨基酰化酶手性拆分N-乙酰-PPT，得到L-草銨膦。用全細胞進行催化，在4小時內轉化率＞49％，獲得了光學純的L-PPT(＞99.9％e.e.)。