[發明專利]功能序列和結構模擬相結合的基因挖掘方法、NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體及應用

在審

• 申請號: 202011613020.8
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112908417A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 薛亞平;程峰;張嘉敏;鄒樹平;徐建妙;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G16B20/50
• 分類號: G16B20/50;G16B35/00;G16B50/30
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

1.一種NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體，其特征在于，由來源于堆肥賴氨酸桿菌(Lysinibacillus composti)的野生型草銨膦脫氫酶突變所得，野生型草銨膦脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體的突變位點選自以下一種：

(1)A144G-V375F-M91A；

(2)A144G-V345A-M91A；

(3)A144G。

2.編碼如權利要求1所述NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體的基因。

3.一種基因工程菌，包括宿主細胞和轉入宿主細胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因包含如權利要求2所述的基因。

4.如權利要求3所述的基因工程，其特征在于，目的基因還包括葡萄糖脫氫酶的編碼基因。

5.如權利要求4所述的基因工程，其特征在于，葡萄糖脫氫酶的編碼基因序列對應的GenBank登錄號為KM817194.1。

6.權利要求1所述NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體、權利要求2所述基因或權利要求3～5任一所述基因工程菌在制備L-草銨膦中的應用。

7.一種L-草銨膦的制備方法，其特征在于，以2-羰基-4-(羥基甲基膦酰基)-丁酸為底物，在無機氨基供體、輔酶再生循環系統及對應輔助底物存在的條件下，利用催化劑催化底物反應獲得L-草銨膦；

所述催化劑為以下一種：

(1)權利要求1所述NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體；

(2)能夠表達權利要求1所述NADH偏好型草銨膦脫氫酶突變體的基因工程菌或該基因工程菌經裂解得到的粗酶液。

8.如權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述輔酶再生循環系統使用葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶或醇脫氫酶偏好型的輔酶再生循環系統。

9.功能序列和結構模擬相結合的基因挖掘方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)分析NADH型谷氨酸脫氫酶應具備的特性序列，特征序列包括：

(1.1)蛋白質大小：候選蛋白質的長度為300-500個氨基酸，

(1.2)草銨膦脫氫酶的兩段必要特性序列：第一段為GGGKGG，其中X位置表示任意一種氨基酸，同時第二段為VVTG、FVTG、VLTG、VFTG、FITG、FFTG、VVFG、FVFTG、VLFG、VFFG、FLFG、FFFG其中之一，

(1.3)NADH結合的特性序列：GXRVXXG；

(2)根據特征序列搜索基因庫；

(3)對步驟(2)搜索獲得的基因進行聚類分析和蛋白結構模擬；

(4)選擇基因聚合度高且蛋白結構與已知草銨膦脫氫酶結構類似的基因作為候選基因。