[發(fā)明專利]通過類器官馴化培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞系的方法及結(jié)直腸癌細(xì)胞系

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011612171.1
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112608900B
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 史媛媛;李程;肖金平;孫志堅
• 申請（專利權(quán)）人: 北京科途醫(yī)學(xué)科技有限公司;浙江科途醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12R1/91
• 代理公司: 北京英創(chuàng)嘉友知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11447
• 代理人: 耿超

1.一種通過類器官馴化培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞系的方法，其特征在于，該方法包括：

將結(jié)直腸癌類器官團(tuán)進(jìn)行消化，得到結(jié)直腸癌類器官中的結(jié)直腸癌單細(xì)胞；其中，所述結(jié)直腸癌類器官團(tuán)中含有類器官載體和結(jié)直腸癌單細(xì)胞，所述結(jié)直腸癌類器官團(tuán)的直徑不小于0.1mm，細(xì)胞團(tuán)活力不小于80％；

依次利用摻有不同摻入比例類器官載體的馴化培養(yǎng)基對所述結(jié)直腸癌類器官中的結(jié)直腸癌單細(xì)胞進(jìn)行馴化培養(yǎng)，得到貼壁生長率大于60％且細(xì)胞活力不小于80％的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，其中，在所述馴化培養(yǎng)過程中，漸次減少所述類器官載體在所述馴化培養(yǎng)基中的摻入比例至0體積％；

所述類器官載體包括Matrigel基質(zhì)膠；

所述摻有不同摻入比例類器官載體的馴化培養(yǎng)基中，所述類器官載體的摻入比例至少包括第一摻入比例和第二摻入比例，所述第二摻入比例小于所述第一摻入比例，在所述馴化培養(yǎng)過程中，當(dāng)與摻有第一摻入比例類器官載體的馴化培養(yǎng)基對應(yīng)的第一馴化培養(yǎng)產(chǎn)物形成的單細(xì)胞懸液密度不小于3×10⁵個/ml且細(xì)胞活力不小于80％時，利用摻有第二摻入比例類器官載體的馴化培養(yǎng)基對所述第一馴化培養(yǎng)產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行馴化培養(yǎng)；

在所述摻有不同摻入比例類器官載體的馴化培養(yǎng)基中，所述類器官載體的摻入比例包括所述馴化培養(yǎng)基的5體積％、1體積％和0體積％；

所述馴化培養(yǎng)基包括2～10體積％的胎牛血清、0.1～0.5mg/ml的CaCl₂、30～60ng/mL的表皮細(xì)胞生長因子、300～500nM的A83-01、5～15mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、1～5mM的Glutamax、5～15μM的人胃泌素、5～15mM的煙酰胺、0.5～2體積％的N2細(xì)胞培養(yǎng)添加劑、50～150U/mL的青霉素、50～150U/mL的鏈霉素以及余量的DMEM/F12培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權(quán)利要求1中任意一項所述的方法，其特征在于，針對摻有任一摻入比例類器官載體的馴化培養(yǎng)基，所述馴化培養(yǎng)包括：

利用摻有當(dāng)前摻入比例類器官載體的馴化培養(yǎng)基對結(jié)直腸癌單細(xì)胞進(jìn)行重懸，得到細(xì)胞濃度為3～4×10⁴個/ml的結(jié)直腸癌單細(xì)胞懸液；

按照300～400μL/孔的接入量，將所述結(jié)直腸癌單細(xì)胞懸液接入細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，放置0.5～2h后，每孔加入100～200μL馴化培養(yǎng)基進(jìn)行馴化培養(yǎng)，培養(yǎng)3～5天后得到馴化培養(yǎng)產(chǎn)物；

對所述馴化培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行計數(shù)和細(xì)胞活力檢測；

重復(fù)上述步驟，直至所述馴化培養(yǎng)產(chǎn)物形成的單細(xì)胞懸液密度不小于3×10⁵個/ml且細(xì)胞活力不小于80％。

3.根據(jù)權(quán)利要求1～2中任意一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括利用結(jié)直腸癌離體組織培養(yǎng)所述結(jié)直腸癌類器官團(tuán)的操作；

其中，所述利用結(jié)直腸癌離體組織培養(yǎng)所述結(jié)直腸癌類器官團(tuán)，包括：

將所述結(jié)直腸癌離體組織進(jìn)行酶解，得到結(jié)直腸癌組織單細(xì)胞；

將所述結(jié)直腸癌組織單細(xì)胞與類器官載體和結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基混合，得到細(xì)胞濃度為3～4×10⁴個/ml的結(jié)直腸癌組織細(xì)胞懸液，其中，所述類器官載體的用量為所述結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基的5～10體積％；

按照300～400μL/孔的接入量，將所述結(jié)直腸癌組織細(xì)胞懸液接入細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中，放置0.5～2h后，每孔加入100～200μL所述結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，每隔3～5天添加150～200μL所述結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)，直至得到直徑不小于0.1mm，細(xì)胞團(tuán)活力不小于80％的所述結(jié)直腸癌類器官團(tuán)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基包括5～15體積％的R-Spondin、20～30ng/mL的Recombinant Human Noggin、5～15μM的SB202190、5～15μM的Y-27632、30～60ng/mL的表皮細(xì)胞生長因子、300～500nM的A83-01、5～15mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸、1～5mM的Glutamax、5～15μM的人胃泌素、5～15mM的煙酰胺、0.5～2體積％的N2、50～150U/mL的青霉素、50～150U/mL的鏈霉素以及余量的DMEM/F12培養(yǎng)基。

5.權(quán)利要求1～4中任意一項所述的方法通過類器官馴化培養(yǎng)得到的結(jié)直腸癌細(xì)胞系。