[發明專利]快速簡易提取厭氧真菌DNA的方法及應用

在審

• 申請號: 202011611015.3
• 申請日: 2020-12-30
• 公開（公告）號: CN112608918A
• 公開（公告）日: 2021-04-06
• 發明（設計）人: 魏亞琴;王霄霄;茍琦敏
• 申請（專利權）人: 甘肅省科學院生物研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 戴治娟

本發明涉及菌株DNA的提取技術領域，具體涉及快速簡易提取厭氧真菌DNA的方法及應用。所述的方法包括如下步驟：(1)菌株培養；(2)收集菌體；(3)破壁；(4)抽提DNA；(5)沉淀DNA；所述的厭氧真菌DNA提取方法，提取DNA的純度和濃度高，且采用液氮研磨冷凍和鋼珠振蕩破碎厭氧真菌細胞壁，破碎過程中所需樣本量較少，不易損失樣本，破壁效果良好，簡單易行。同時，本發明所述的抽提緩沖液配方簡單，成本低廉，提取DNA的效果良好；采用本方法提取厭氧真菌的DNA操作簡易，實驗重復性好，能夠獲得高質量的DNA，對于促進厭氧真菌的研究具有重大意義。

技術領域

本發明涉及菌株DNA的提取技術領域，具體涉及快速簡易提取厭氧真菌DNA的方法及應用。

背景技術

厭氧真菌的DNA提取是厭氧真菌分子生物學研究中一項重要工作。目前，真菌基因組提取方法主要有CTAB法、SDS提取法、尿素提取法及酶解法等。上述提取方法的提取步驟大體相似，關鍵在于如何有效的破碎細胞壁。目前，常用的厭氧真菌細胞破壁的方法有(1)經典的液氮研磨法。(2)液氮凍融(和玻璃珠振蕩)法。該方法使用液氮，增加了成本及設備要求；(3)酶解法。用于絲狀真菌破壁的酶比較昂貴，在處理大量樣品時很不經濟；(4)化學試劑(氯化芐)法。化學試劑存在環保上的隱患。

上述提取厭氧真菌DNA的方法大多為液氮研磨破碎厭氧真菌的細胞壁，但是破壁效果差，或用專用細胞破碎儀破碎厭氧真菌的細胞壁，然而細胞破碎儀的成本高，破壁過程繁瑣，普及率不高。本領域技術人員最常用的真菌基因組提取方法是CTAB法，但CTAB法提取過程繁瑣，所需試劑種類繁多，提取效果一般。針對上述技術問題，本領域技術人員研究出來了用于提取厭氧真菌DNA的試劑盒，提取效果較好，但是試劑盒的價格昂貴，且提取的次數有限，不能滿足研究人員在研究過程中進行大量的實驗或者是重復多次驗證實驗效果，且部分試劑盒在提取的過程中還需要補充配制加入指定試劑來提高提取效果。

發明人在研究過程中發現，厭氧真菌由于其細胞壁含有幾丁質，又稱殼多糖，為N-乙酰葡糖胺通過β連接聚合而成的結構同多糖。其不溶于一般的弱無機酸或有機溶劑，且不溶于堿液中，只溶于強無機酸。使得真菌的細胞壁破壁困難，本領域技術人員在提取厭氧真菌DNA的時候因無法破壁而導致提取效果不好。

針對上述技術問題，發明人為了更好地研究厭氧真菌的遺傳信息，提取厭氧真菌基因組DNA。發現了一種適用于厭氧真菌基因組DNA提取的方法，所述的方法具有成本低、樣本量少、提取快速、操作簡便的特點，解決使用常規方法所獲得的DNA樣品提取時間長的問題。

發明內容

本發明的目的是針對目前提取厭氧真菌DNA技術的不足，提出的一種低成本的、所需樣本量少、快速的、簡便易行的、高效提取厭氧真菌DNA的新方法。

快速簡易提取厭氧真菌DNA的方法，所述的方法包括如下步驟：

(1)菌株培養：將厭氧真菌接種在厭氧培養基里，加入復合抗生素，靜置培養；

(2)收集菌體：將步驟(1)得到的菌液離心，取菌絲體；

(3)破壁：將步驟(2)得到的菌絲體被液氮快速研磨后取少量加入到離心管中，再加入鋼珠，迅速冷卻，振蕩離心管，使厭氧真菌細胞壁破碎；

(4)抽提DNA溶液：向步驟(3)得到的溶液中加入抽提緩沖液，振蕩，恒溫水浴，加入乙酸銨，混勻，冷卻，離心，取上清液，棄沉淀物和鋼珠；上清液用等體積的Tris飽和酚：氯仿：異戊醇溶液抽提2次，混勻，離心，去除雜蛋白；

(5)沉淀DNA：取步驟(4)得到的上層水相至另一離心管中，加入異丙醇，混勻，低溫放置以沉淀DNA；離心，棄上清，用乙醇洗滌沉淀，用無菌雙蒸水溶解沉淀，即得厭氧真菌DNA。