[發明專利]快速簡易提取厭氧真菌DNA的方法及應用在審
| 申請號： | 202011611015.3 | 申請日： | 2020-12-30 |
| 公開（公告）號： | CN112608918A | 公開（公告）日： | 2021-04-06 |
| 發明（設計）人： | 魏亞琴;王霄霄;茍琦敏 | 申請（專利權）人： | 甘肅省科學院生物研究所 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504 | 代理人： | 戴治娟 |
| 地址： | 730000 甘肅*** | 國省代碼： | 甘肅;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 快速 簡易 提取 真菌 dna 方法 應用 | ||
1.快速簡易提取厭氧真菌DNA的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟：
(1)菌株培養：將厭氧真菌接種在厭氧培養基里，加入復合抗生素，靜置培養；
(2)收集菌體：將步驟(1)得到的菌液離心，取菌絲體；
(3)破壁：將步驟(2)得到的菌絲體被快速液氮研磨后取0.1-1g加入到離心管中，再加入鋼珠，冷卻，振蕩離心管，振蕩期間離心管保持冷凍狀態，使厭氧真菌細胞壁破碎；
(4)抽提DNA：向步驟(3)得到的溶液中加入抽提緩沖液，振蕩，恒溫水浴后，加入乙酸銨，混勻，冷卻，離心，取上清液，棄沉淀物和鋼珠；上清液用等體積的Tris飽和酚：氯仿：異戊醇溶液抽提2次，混勻，離心，去除雜蛋白；
(5)沉淀DNA：取步驟(4)得到的上層水相至另一離心管中，加入異丙醇，混勻，低溫放置以沉淀DNA；離心，棄上清，用乙醇洗滌沉淀，用無菌雙蒸水溶解沉淀，即得厭氧真菌DNA。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的厭氧培養基的配制步驟如下：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，NaHCO3 7.0g，刃天青1.0g/L 1mL，L-半胱氨酸鹽酸鹽1.7g，晨飼前采集瘤胃液8000×g，4℃離心20min后的上清170mL，鹽溶液I 165mL，鹽溶液II 165mL，蒸餾水定容至1000mL；鹽溶液I的配制步驟如下：NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO43g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸餾水定容至1000mL；鹽溶液II配制步驟如下：K2HPO4 4g，蒸餾水定容至1000mL。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)厭氧真菌的接種量為10％v/v，復合抗生素的接種量為1％v/v，所述的復合抗生素具體為復合抗生素為青霉素鈉和硫酸鏈霉素，終濃度分別為1600IU/mL和2000IU/m L。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的菌液離心的轉速為5000g/min，離心時間為5min。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的冷卻是液氮快速研磨菌絲體后將0.1g被研磨的菌絲體置于離心管中，再加入鋼珠2顆，將離心管放在液氮中冷卻，振蕩離心管，振蕩過程中離心管保持冷凍狀態，振蕩時間為3-5min。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述的抽提緩沖液的配制步驟如下：Tris2.4228g，NaCl 1.461g，乙二胺四乙酸二鈉0.9306g，十二烷基硫酸鈉2g，蒸餾水定容100mL，并用HCl調pH值至8.5。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述的乙酸銨加入量為濃度10M 200μL，Tris飽和酚：氯仿：異戊醇溶液的加入量是與上清液等體積。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)所述的異丙醇加入量為上層水相的0.5-0.6倍體積，且所述的異丙醇于-20℃預冷。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)所述的無菌雙蒸水的加入量為50μL。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)所述的乙醇加入量為1mL 75％。
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